一、材料

1.缓冲液和溶液

细胞清洗缓冲液（0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)，0.05mol/LEDTA(pH8.0)，室温存放。）

EDTA(0.05mol/L,pH8.0)

L缓冲液（0.1mol/LEDTA(pH8.0)，0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)，0.02mol/LNaCl，4℃存放）

含蛋白酶K和十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl)的L缓冲液

TE（pH7.6）

含40μg/mlPMSF的TE（pH7.6）

酵母裂解缓冲液（0.01mol/LTris-Cl（pH7.6），0.5mol/LEDTA（pH8.0），β-巯基乙醇（1%V/V））

酵母细胞壁消化酶

酶解酶（Zymolyase）5000（KirinBreweries）或溶细胞酶（Lyticase）（67mg/ml）（Sigma）

2.凝胶

低熔点琼脂糖（1%）

3.离心机和转头

SorvallGSA转头或相当型号的转头

4.专用设备

预成型的Plexiglas模具（50~100μl，Pharmacia或Bio-Rad),或一个长的Tygon管（1/8英寸或内径3.2mm),或一个塑料注射器（1ml）。

5.细胞和组织

酵母混悬培养物

二、方法

1.3000g(SorvallGSA转头4300r/min)4℃离心5min收集混悬培养的酵母细胞。用细胞清洗缓冲液洗两次细胞沉淀。

2.混悬细胞于0℃的0.05mol/LEDTA（pH8.0）中，浓度3X10⁹个细胞/ml。

3.用L缓冲液配制1%低熔点琼脂糖。熔化后，冷却至42℃。

4.加75μl酶解酶或溶细胞酶溶液到步骤2的细胞混悬液内，混匀。

5.加热细胞混悬液至42℃。将5ml熔化的琼脂糖和5ml细胞混悬液混合。用一个封口的巴斯德吸管搅匀混合物，以保证细胞完全分散在琼脂糖中。

6.混合物移入预成形的Plexiglas模具（50~100μl，Pharmacia或Bio-Rad),或吸混合物到合适长度的Tyson管（内径3/32英寸）内，也可以吸入1ml塑料注射器内。室温放置15min，再移至4℃放15~30min。

7.琼脂糖凝固后，从Plexiglas模具收集凝胶栓，或从Tygon管和注射器挤出凝胶。将圆柱形凝胶栓切成1cm长的段。

8.3倍体积酵母裂解缓冲液内37℃温育凝胶块3h，化学通风橱内进行。

9.干净培养皿内加入3倍体积含有0.1mg/ml蛋白酶K和1%(m/V）Sarkosyl的L缓冲液。移入凝胶块，50℃温育3h。用新鲜等体积上述缓冲液替换旧的，继续50℃温育12~16h。

10.在50倍体积含40μg/mlPMSF的TE(pH7.6)50℃温育凝胶块1h。用新鲜等体积上述溶液替换旧的，继续50℃温育1h。

11.除去含PMSF的TE,用新鲜等体积TE(pH7.6)室温继续温育1h。