1.从培养皿中转移细胞。.

如果是贴壁细胞，用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml吸管将细胞和培养基转移到15ml离心管中。

如果是悬浮细胞，直接将细胞和培养基转移到离心管中。

2.480g、4°C，离心沉淀细胞5min。

3.弃去上清，勿搅动沉淀。

要点：操作以下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或振荡时，保持细胞在冰上。

4.在离心管中加IOml冰冻PBS洗涤细胞，来回吹打重悬细胞。

5.480g、4°C，再次离心细胞5min。

6.弃去上清，勿搅动沉淀。

7.重复步骤4~6两次。

8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。

9.用吸管将抽提缓冲液加到离心管中。

依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。细胞裂解液的蛋白质浓度应为10mg/ml，不应超过20mg/ml。

10.旋涡混合器振荡离心管10~30s，重新悬浮沉淀。

11.每1Oml抽提缓冲液中加50ulIPG缓冲液，IPG缓冲液终浓度为0.5%。

12.将细胞裂解液转移到一个合适的超速离心管中。

13.100000g离心20min。

14.收集上清，小心避免试管底部的清澈黏性的液滴（DNA和RNA)混入上清。

15.用BCA方法测定蛋白质浓度（见附录2)。

注意：如果用BCA检测，要从抽提缓冲液中去除DTT,因为DTT会干扰分析。样品分析完之后，在样品中加DTT至终浓度为50mmol/L。

16.将上清分成几等份，每份lOOjtxl或200沁。

每一等份的大小取决于待测样品的量。如果不立即用于IEF，将样品储存在一80°C。

17.按方案5进行第一向IEF。