非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(Native-PAGE)

一、实验目的

1

、了解非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和优势；

2

、掌握如何活性电泳和染色的步骤。

二、实验原理

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(Native-PAGE)

或称为活性电泳是在不加入

SDS

和疏基

乙醇等变性剂的条件下，

对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，

常用于酶的鉴

定、同工酶分析和提纯。未加

SDS

的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电

泳过程中保持其天然的形状和电荷，

它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分

子筛作用，

因而可以得到较高的分辨率，

尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生

物大分子的生物活性，

对于生物大分子的鉴定有重要意义，

其方法是在凝胶上进行两份

相同样品的电泳，

电泳后将凝胶切成两半，

一半用于活性染色，

对某个特定的生物大分

子进行鉴定，

另一半用于所有样品的染色，

以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性

SDS-PAGE

电泳在操作上基本上是相同的，只是非

变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如

SDS

等。一般蛋白进行

非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低

pH

凝胶

系统，分离酸性蛋白时候，要利用高

pH

凝胶系统。

酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳

中采用的

pH

是

8.8

的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动；而碱性蛋白通

常电泳是在微酸性环境下进行，

蛋白带正电荷，

这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电

泳分离碱性蛋白。

三、实验器材与试剂

1

、电泳仪、电泳槽、离心机等

2

、丙烯酰胺、

Tris

、

HCl

、溴酚蓝、

ABTS

等

四、实验步骤

1

、

PAGE

胶电泳缓冲液配置

1

）

丙烯酰胺单体贮液：

14.55g

丙烯酰胺加上

0.45gN

，

N -

甲叉双丙烯酰胺，

先用

40mL

双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至

50mL

，过滤。用棕色瓶

4°

C

保

存备用。

2)

浓缩胶缓冲液贮液

(0.5mol/L

Tris-HCl

，

pH6.8)

：

3.03gTri

s

溶解在

40mL

双蒸水中，用

4mol/L

盐酸调

pH6.8

。再用双蒸水稀至

50mL

。保存在

4°

C

备用。

3)

分离胶缓冲液贮液

(1.5mol/LTris-HCl

，

pH8.9)

：

18.16gTris

溶解在

80mL

双蒸水中，

用

4mol/L

盐酸调

pH8.9

。再用双蒸水稀至

100mL

，保存在

4°

C

备用。

4)10

％（

AP

）过硫酸铵：

0.1g

过硫酸铵溶入

1.0mL

双蒸水，使用前新鲜配制。

5)

电极缓冲液

(0.025mol/L

Tris

，

0.2mol/L

甘氨酸，

pH8.3)

：

15.14gTris

加上

72.07g

甘氨

酸，用双蒸水稀释到

5L

。可在室温保存一个月。

6

）

样品缓冲液

（

0.1mol/LTris-HCl

，

pH6.8

）

：

2ml

浓缩胶缓冲液贮液加上

1mL87%

甘油、

0.1mg

溴酚蓝，用双蒸水稀释至

10mL

，可在

-20°

C

保存

6

个月。

2

、活性

PAGE

配方

分离胶：