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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验一电泳法
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| 实验方法原理 | 在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 |
|---|---|
| 实验材料 | 质粒DNABAC |
| 试剂、试剂盒 | 琼脂糖溴酚蓝溴化乙锭 |
| 仪器、耗材 | 制胶板电泳槽紫外透射仪 |
| 实验步骤 | 1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 2. 调整好梳子的高度； 3. 称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50篊时倒入制胶板中； 4. 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； 5. 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5mltube中混合后点样； 6. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动； 7. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5礸/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。 |
| 注意事项 | 1. 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： （1）DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA） （2）胶浓度，U为迁移率，U0t琼脂糖浓度：logU=logU0Kr为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率，
（3）DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 （4）所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm （5）碱基组成与温度：一般影响不大4-30℃ （6）嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) （7）电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。 2. 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3. 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 |
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