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二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品制备一可溶性样品
蚂蚁淘
/发布时间:1533403819 /浏览量:160
| 实验方法原理 | 由于2-DE所分析样品的多样性，没有一种制备方法可以普遍适用于各种样品，但有几点考虑一定要提出，很有必要尽量减少可能在2-DE谱中导致假点(artifactualspot)的蛋白质修饰，在实验中，含尿素的样品一定不要加热，因为加热后尿素分解产生的异氰酸盐可能对蛋白质产生氨某甲酰化修饰从而引起很大的电荷不均一性。此外，样品中的蛋白酶可以很容易地生成假点，因此，样品处理步骤应尽量少并保持冷冻环境。样品中可以加入蛋白酶抑制剂的混合物，但切记这些试剂可修饰蛋白，导致电荷假象。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 血清、血浆、尿样脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物 试剂、试剂盒 | TCA丙酮
实验步骤 | 可溶性液体样品如血清、血浆、尿样，脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行2-DE分析。含蛋白质浓度较高的样品，如血浆和血清，可用适量样品溶解缓冲液稀释后肯接分析。但是，诸如白蛋白和免疫球蛋白一类的高丰宽蛋白质在2-DE图谱上常干扰其他表达量少的成分，将这些高丰度蛋白质去除可以克服这个问题,但同时叶能非特异性去除其他蛋白质。其他类型的液态样品可能含有较低的蛋白质浓度或较高盐浓度，将会干扰IEF时蛋白质的分离，这种样品可在2-DE分离前用透析或液相色谱脱盐，样品可以通过冻干，对聚乙二醇的透析或用TCA/丙酮沉淀的方法进行浓缩。研究发现TCA/丙酮沉淀对导致蛋白酶的失活进而减少蛋白质降解非常订用，同时可以排除干扰化合物，富集机械性蛋白质，如从全细胞裂解液中富集核糖体蛋白。 注意事项 | 其他 |
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