一、样品还原

1.在还原缓冲液中，溶解蛋白质样品（约10mg蛋白/ml)。

2.加入准确称量的物质的量大约是蛋白质60倍的固体DTT(比如，大约是蛋白质重量的一半），或使其终浓度为0.lmol/L。

3.在溶液上方轻轻吹氮气（或氩气）30s。

可以在氮气罐调节阀的聚乙烯塑料管口接一根巴斯德吸管，调节氮气流以至于手背基本觉察不到。

4.37°C孵育蛋白质溶液3h。

5.如果需要，-SH基团的数量可以用Ellman法测定（见方案4)。

二、样品烷基化

有些情况下，经还原和烷基化的蛋白质可以通过RP-HPLC迅速脱盐，然后在少量易挥发溶剂中复性。这种方法对于低分子质量（10~25kDa)的蛋白质，比如生长因子和细胞因子尤为有效。利用RP-HPLC(TFA/乙腈溶剂系统）脱盐（和样品浓缩），已经成功地应用于微量样品（见方案3)。

6.在冰上冷却、还原蛋白底物溶液。

7.加人新鲜配制的溶解于少量（约0.2ml)烷基化缓冲液中的碘乙酸（最多与蛋白质底物等质量或者用少量的碘乙酸钠贮备液（每100ulO.lmol/LNaOH中溶入15mg碘乙酸），使其物质的量略大于混合物中-SH基团的数量（即蛋白质的-SH基团加上DTT)。

8.轻轻拍打管壁，混匀管中的内容物。

9.用氮气注满反应管，持续30s。

10.室温避光，孵育反应15min。

避光反应是为了防止碘乙酸分解产生碘离子。

11.加入稍过量的卜巯基乙醇（每5mgDTT约50ul），以去除多余的烷基化试剂，终止反应。

12.用浓盐酸调节溶液的pH为2~3滴0.5ul的反应混合物到pH试纸上，以检查溶液的pH。

我们推荐用小规模的实验来检验烷基化蛋白质的可溶性（由于蛋白质不同其溶解性会有显著差别）。可选用的易挥发的溶液和缓冲盐包括1mol/L乙酸（pH2.1)，10g/LNH4HCO3(pH7.8)和0.2mol/LN-乙基吗啉乙酸缓冲液（pH8.0)。蛋白质可以通过冻干从这些溶液中提取。

三、S-羧甲基蛋白质的回收（脱盐）

经还原和烷基化的蛋白质，可以在挥发性溶液（比如1mol/L乙酸）中析出，或从缓冲盐溶液（比如碳酸氢铵）中脱盐。可是这一方法费时（一般24h中需要换几次透析液），而且蛋白质损失较大。透析后的蛋白质可以通过冻干回收。

13.去掉多余的试剂，通过尺寸排阻层析，使蛋白质快速脱盐。

14.用冻干的方法，使还原和烷基化的蛋白质从1mol/L乙酸中回收，制成干粉。