在质粒载体中进行平末端片段的克隆

1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。

2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。

3．分别用TE（pH8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100ng/ml。假设1bp相当于660Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。

4．将载体DNA去磷酸化。

5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5ml离心管：

¹载体DNA已进行去磷酸化

²外源目的DNA可以连接接头。

3连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/μl。

a.A、B和C管中加入：

10×连接缓冲液1.0μl

T4噬菌体连接酶0.5Weiss单位

5mmol/LATP1.0μl

H₂O补至8.5μl

30%PEG80001~1.5μl

b.D、E和F管中加入：

10×连接缓冲液1.0μl

5mmol/LATP1.0μl

H₂O补至8.5μl

30%PEG80001~1.5μl

不加DNA酶

6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4h。

7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。

¹去磷酸化

²未去磷酸化

³如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。

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