一、材料

1.试剂

（1）dNTP溶液（含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，每种浓度10mmol/L)多数情况下，直接替换dUTP就可以了（RySandPersingl993;Koxetal.1994)。如果必要的话，为了补偿对聚合酶的抑制作用，dUTP终浓度可提高到0.6~1mmol/L(Wangetal.1992;Hohlfeldetal.1994)。

（2）MgCl₂溶液，50mmol/L

多数情况下Mg²⁺终浓度达到1.5mmol/L就足够了，然而应根据核苷酸（如dUTP)浓度和引物特异性适当优化。提高核苷酸浓度同时应提高Mg²⁺浓度。

（3）PCR缓冲液，10X(100mmol/LTris-HCl,pH8.4,500mmol/LKCl）

2.引物

正向引物（l0umol/L)

反向引物（l0umol/L)

3.酶

（1）尿嘧啶-DNA-糖基酶，1U/ul（Invitrogen)

1UUDG可以去除5ng污染物，根据要求的净化程度可以减少到0.01活性U(KoxetaL1994)B（2）TaqDNA聚合酶5U/ul

热启动Platinum7"叫DNA聚合酶Invitrogen10966-018)允许在室溫条件下准备PCR反应液。

4.设备

可以设定程序（注意在「二、方法」中的（3）和（4）有修改）的PCR仪、PCR扩增用薄壁离心管。

二、方法

（1）在灭菌的离心管中于冰上加入下列试剂。

10xPCR缓冲液               5ul

dNTP溶液                       1ul
注：dNTP溶液，含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP,每种浓度10mmol/L

正向引物、反向引物           1ul（每种l0umol/L）尿嘧啶-DNA-糖苷酶1U/ul      1U

TagDNA聚合酶（5U/ul）     0.5ul

MgCl₂(50mmol/L)                1.5ul

H₂0                                        40ul

（2）37°C温育l0min。

这一步UDG可以从污染物中去除屎嘧啶残基。据报道这一净化过程也可以在室溫条件下完成（dcWitetal.1993；Wangetal.1992).

（3）94°C加热l0min,失活UDG并水解污染的DNA(Hohlfeldetal.1994;Koxetal.1994)。

（4）在标准PCR基础上增加2个循环。

增加2个循环可以补偿dUTP对扩增效率的影响（Longoetal.1990)。

（5）在PCR结束之前，将温度保持在72°C,直至储存。

据报道，PCR结束后如果降低温度，大肠埃希菌UDG会恢复一小部分催化活性。

（6）把含尿嘧啶DNA以及含有UDG活性的反应混合物-20°C保存。