一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

去除RNA酶的双蒸水

10XRT-PCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.3,500mmol/LKC1，15mmol/LMgCl₂)

2.酶和酶缓冲液

TaqDNA聚合酶（5U/ul)

3.核酸和寡核苷酸

dNTP混合物（10mmol/L，包含所有四种dNTP)

基因特异的正向引物（5umol/L)

基因特异的反向引物（5umol/L)

单链cDNA(见第一部分）

4.放射性复合物

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37GBq)

5.实验器材

薄壁的PCR管

6.专用仪器

可编程的PCR仪

二、方法

1.准备PCR反应混合物。

由第一部分制得的cDNA                     11ul

10XRT-PCR缓冲液               55ul

10mmol/LdNTP混合物                     44ul

5umol/L基因特异的正向引物            22ul

5umol/L基因特异的反向引物            22ul

5U/ulTaqDNA聚合酶                          2.75ul

去除RNA酶的双蒸水             387.75ul

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)                        5.5ul

2.平均50ulPCR反应混合物分别放入10个薄壁PCR管中。

3.带有热盖的适当的PCR仪（如：GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems)

上运行PCR。PCR扩增的循环参数如下。

94°C30s

退火温度30s

72°C30s

35个循环

4.每次奇数脉冲循环后放在冰上取样，由第15个循环起始，到第35个循环终止。

5.变性聚丙烯酰胺凝肢（6%丙烯酰胺/8mol/L尿素）上分析样品。每个样品上样

10ul。滤纸上干燥凝肢，用Phosphorlmager或X射线片和densitometer对产物定量，也可以将产物条带从凝胶上切下，通过闪烁记数仪定量。

6.信号的对数（y轴）对应循环数（x轴）作图。选择处于线性范围中心的循环数在后

续实验中使用。