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PCR扩增产物的克隆一平端连接法
蚂蚁淘
/发布时间:1626888602 /浏览量:290
| 实验方法原理 | 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoRV或SmaI切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。 如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG8000，也只能很有限地提高效率。 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3"末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3"突出一个碱基的DNA分子。 这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10uT4RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。 对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3"末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 模板DNA 试剂、试剂盒 | SauIKlenow片段T4连接酶 仪器、耗材 | 移液器移液器吸头PCR小管DNA扩增仪电泳槽电泳仪台式高速离心机
实验步骤 | 一、PCR反应 1. 依次混匀下列试剂 （1）H2O：35μl （3）25mmol/LMgCl2：4μl （4）4种dNTP：4μl （5）上游引物（引物1）：0.5μl （6）下游引物（引物2）：0.5μl （7）模板DNA（约1ng）：0.5μl （8）混匀后离心5秒。 2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入TaqDNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。 3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。 二、电泳 取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。 三、PCR产物的纯化 扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。 1. 酚/氯仿法 （1）取反应产物加100μlTE。 （2）加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次，可除去覆盖在表面的矿物油。 （3）再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。 （4）在水相中加300μl95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。 （5）在小离心机上10000rpm离心10min，吸净上清液。加入1ml70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7mlddH2O中，待用。 2. WizardPCRDNA纯化系统 WizardPCRDNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50mlWizardPCRDNA纯化树脂、5ml直接提取缓冲液、50支Wizard微型柱。 （1）吸取PCR反应液水相放于1.5mlEppendorf管中。 （2）加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。 （3）加1mlPCRDNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。 （4）取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。 （5）将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入2ml80%异丙醇，对微型柱进行清洗。 （6）取出微型柱置于eppendorf管中，12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。 （7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μlTE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。 （8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。 四、载体加dT尾 1. 将1μgpUC19用SmaⅠ全酶切。 2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4μl4种dNTP改为4μl25mMdTTP。 3. 加入1μl(5U)的TaqDNA聚合酶在72℃下加热2h。 4. 按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。 5. 加入2倍体积95％乙醇，在-20℃下沉淀1h。 6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10mlddH2O中。 五、PCR产物与载体粘末端连接 1. 在7mlPCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。 2. 加1mlT4DNA连接酶，1ml10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。 3. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。 六、PCR产物3"突出端切平及平末端连接 1. 在50ml的PCR产物中，直接加0.5mlT4DNA聚合酶混匀。 2. 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。 3. 用酚:氯仿抽提2次。 4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7mlddH2O中。 5. 质粒用Smal切开后，70℃15分钟灭活酶，取1ml（约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4DNA连接酶1ml，连接缓冲液1ml。 6. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。 注意事项 | 1. PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。 2. PCR非常灵敏，操作应尽可能在无菌操作台中进行。 3. 吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。 4. 加试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 5. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。 7. PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的产量。 其他 | 一、PCR反应中的主要成份 1. 引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： （1）引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。 （2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。 （3）四种碱基应随机分布，在3"端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。 （4）引物3"端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。 （5）在引物内，尤其在3"端应不存在二级结构。 （6）两引物之间尤其在3"端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 （7）引物5"端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5"端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 （8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。 （9）简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met，3"端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 （10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算： Xmol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X：引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) （1）dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。 （2）dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 （3）理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 3. Mg2+ （1）Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。 （2）通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。 （3）在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。 4. 模板 （1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。 （2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102-105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。 （3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。 （4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5. TaqDNA聚合酶 一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μlPCR反应中，1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。 所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。 反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活TaqDNA聚合酶，灭活TaqDNA聚合酶的方法有： （1）PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。 （2）加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。 （3）99-100℃加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。 6. 反应缓冲液 （1）反应缓冲液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 （2）反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。 （3）各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
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