材料

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录1。
将贮存液稀释到合适的浓度。

10x扩增缓冲液

含有四种dNTP的混合溶液，每一种dNTF的浓度为2.5mmol/L

酶和缓冲液

热稳定DNA聚合酶[Hot-TubDNA聚合酶（Amersham)或同类产品]
大多数DNA聚合酶保存在含50%甘油的贮存液中。这种溶液非常粘稠，很难准确取量。最简单的方法是在微型离心机上将含酶的离心管在4°C以最大转速离心10s,然后用一个可调式移液器取出所需数量的酶。用一个带屏障装置的自动移液器装配PCR反应成分。

凝胶

1%的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（含0.5ug/ml溴化乙锭）。

核酸和核苷酸

引物
将正向和反向内引物以100umol/L(100pmole/ul)的浓度溶解在水中。
将诱变引物以10mmol/L(10pmole/ul)浓度溶解在水中。

模板DNA

通过溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心（第1章方案10或11)或用Qiagen树脂柱层析纯化超螺旋双链质粒DNA(第1章方案9)。将模板DNA以0.1ug/ml的浓度溶解在TE(pH8.0)溶液中。

专用设备

带屏障装置的自动移液器用吸头

微型离心机用离心管（扩增用0.5ml薄壁管）

可调式移液器

可按所需扩增条件设定程序的热循环仪
如果热循环仪不配备加热盖装置，使用矿物油或石蜡油以防止PCR过程中反应混合物液体挥发。

其他试剂

本方案步骤6所需的试剂列在第1章方案17或19中。

方法

1.使用0.5ml微量离心管或扩增反应管（置冰上），混合下列第一轮扩增反应需要的

试剂：

10X扩增缓冲液10ul
质粒DNA模板200~400pg
2.5mmol/LdNTP溶液8ul
诱变引物10pmoles
低Tm值侧引物lOOpmoles
热稳定DNA聚合酶0.5ul(2.5单位）
加水至100ul

如果厂商提供的热稳定DNA聚合酶10x扩增缓冲液中不含MgCl2,加入所需体积的0.1mol/LMgCl₂，使反应混合物中含有DNA聚合酶反应最适浓度的二价离子。

2.如果热循环仪没有加热盖，加入一滴石蜡油（约50ul)覆盖PCR反应。将反应管放置在热循环仪中。

3.用下表中给出的变性、退火、聚合反应所需的时间和溫度扩增核酸


上述反应条件适合于0.5ml薄壁管和100ul反应体积，在Perkin-Elmer96009700,MasterCycler(Eppendorf)或PTC.100(MJResearch)热循环仪上进行：使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。每1000bp长的靶DNA聚合反应应进行1min。

4.第一次PCR反应完成后再把下列成分加入到同一反应管中：

髙了Tm值的侧引物100pmoles
热稳定DNA聚合酶0.5ul(2.5个单位）
2.5mmol/LdNTP溶液3ul
用移液器温和的上下吸打几次混匀上述反应物。可离心几秒钟，将所有的试剂收集到离心管底部。
可以取3~5ul第一次PCR反应混合物，经琼脂糖凝胶电泳快速分析证实是否成功的合成了大引物PCR产物。

5.接下来进行第二轮扩增反应，反应由25个循环和二步温度组成：

94°C,40S
72°C,90s最后的延伸步骤为72°C,5min。

6.取第二轮PCR扩增反应的5%进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，估计扩增出的靶DNA浓度。
如果引物内设置了限制酶位点，用相应的限制酶消化扩增DNA,然后次级克隆进适合的载体。也可以将步骤5磷酸化的扩增DNA连接至限制酶消化后产生纯端的质粒载体中。这种方法的诱变率大约为80%,通常仅需要挑选6个克隆进行DNA序列分析确认存在所希望的突变体，并肯定在DNA全序列中不存在其他的突变。