2021-08-17如何进行目的基因片段分离，克隆和分析

离目基物芯片高密度固定固相支持介质物信息微列阵列阵每序列及位置都已知并按预先设定顺序点阵基芯片物芯片种其固定核算类物质主要用于DNA、RNA析DNA芯片微点阵两种离目基指基组发现或找某目（标）基目前通①比较同物种间或同物种同体间；或同体同发育期或同环境条件基差异表达（基表达平行析）实现采用基芯片技术进行基差异表达研究通杂交直接检测细胞mRNA种类及丰度与传统差异显示相比具品用量自化程度高检测目标DNA密度及并行种类等优点②利用同源探针cDNA或EST微列阵筛选离目基目前DNA 芯片、cDNA芯片两种其基本步骤包括：基芯片制备、靶品制备、杂交与检测、目基离并获全2 基文库技术离目基基文库指某物类型全部基集合种集合重组体形式现某物DNA片段群体与载体重组重组转化宿主细胞转化细胞选择培养基单菌落（或噬菌斑或细胞）即DNA片段克隆全部DNA片段克隆集合体即该物基文库其类型基组文库与cDNA文库、克隆文库与表达文库按载体智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、工染色体文库等基文库构建文库筛选基主要几种：核算杂交、免疫检测、DNA同胞选择、PCR筛选等基文库构建目前基工程核工作离目进用3 功能蛋白组离目基蛋白组指细胞内全部蛋白存及式即基组表达产总蛋白质统称功能蛋白质组指些能涉及特定功能机理蛋白质群体主要研究蛋白质双向电泳通高效液相色谱、质普蛋白质序列进行析借用物手段则进行目基离：应用PCR进行离目基：通蛋白质序列析通密码简并性设计简并引物利用RT-PCR 目基全；应用核算杂交筛选离目基：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基组文库；免疫雪筛选离目基：通蛋白特异抗体与目蛋白专结合表达文库离目基蛋白基4 PCR技术基克隆应用PCR技术已经渗透物各领域克隆获cDNA全面起着重要作用利用 PCR技术特定条件基表达进行检测即通mRNA差别显示（DDRT-PCR）鉴定离所需目基；通RT-PCR克隆目基 cDNA区域进行cDNA文库构建通锚定PCR或反向PCR快速克隆cDNA末端未知序列、功能基调控区等现用于基离克隆 PCR主要：RT-PCRDDRT-PCR用于cDNA末端快速克隆RACE（第3节）用于DNA序列克隆Panhankle- PCR、Cassette-PCR及减cDNA文库PCR构建等Panhankle-PCR、Cassette-PCR基组已知DNA相临未知序列克隆奠定良基础5 mRNA差别显示技术离差别表达基mRNA差异显示技术组织特异性表达基进行离种快速行效mRNA反转录与PCR技术结合发展起种RNA指纹图谱技术利用5’锚定引物oligo（dT）12MN3’端随机引物总mRNA进行PCR扩增期差异表达条带并其差异显示条带进行收、克隆6 插入突变离克隆目基获突变体进行未知基克隆用举T-DNA标签转座诱变离克隆目基例T-DNA标签T-DNA任何兴趣基处产插入性突变获析该基功能照突变体T-DNA左右边界间携带外源报告基片段作选择性遗传标记插入序列已知获转基重组突变体通各种克隆PCR策略加研究倘若35S强启T-DNA整合宿主基组整合内原基游则产异增加或表达空特异性改变破坏基表达效获性突变功能丧失性突变等转座标签株携带功能性转座系统植物与遗传差异同种植物杂交转座插入某特定基序列破坏该基编码蛋白进导致见表性破坏或改变产代筛选新型突变体