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间接原位PCR（原位杂交PCR）
蚂蚁淘
/发布时间:1628703001 /浏览量:48
| 实验材料 | 组织或细胞样品 试剂、试剂盒 | SSC硫酸葡聚糖甲酰胺脱脂奶粉Denhardt’s液SDS变性的鲑鱼精DNARnaseDTT乙醇 仪器、耗材 | 玻片石蜡膜橡皮泥湿盒
实验步骤 | 一、预杂交 1. 试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉 2. 操作方法 （1）在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15min； （2）用50%去离子甲酰胺37℃孵育15min； （3）加预杂交液20μl/片，在杂交温度下孵育30min～2h。 二、杂交 1. 试剂与配制 杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s液，2%SDS，10mg/ml变性的鲑鱼精DNA 2. 操作方法 （1）弃预杂交液，加杂交液（含0.2～5μg/ml探针）10～20μl/片，覆盖经硅化的盖玻片，石蜡膜封片或橡皮泥封片； （2）玻片置于湿盒中，42℃杂交12～18h（过夜，但不能超过24h）。 三、杂交后处理 1. 试剂与配制 2×SSC Rnase（20μg/ml） 50%去离子甲酰胺 10mmol/LDTT 2. 操作方法 1. 杂交完毕，用2×SSC浸泡玻片数分钟，轻轻移去盖玻片，再用2×SSC洗玻片1～2min； 2. 2×SSC（含20μg/mlRNase，适宜RNA探针，DNA探针可省略此步）中洗片30min，37℃； 3. 2×SSC/50%去离子甲酰胺，42℃×10min； 4. 1×SSC/50%去离子甲酰胺，37℃×30min，2次； 5. 4×SSC/10mmol/LDTT洗1h； 6. 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30min； 7. PBS中洗10min，即可进行显色，方法同上。 注意事项 | 1. 如果检测mRNA，双链探针应变性处理，方法是95～100℃加热10min后迅速置于冰中骤冷； 2. 以单链探针检测DNA时，DNA也需变性处理，将玻片置于70～80℃变性液（70%去离子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10min； 3. 用双链探针检测DNA时，可按上述方法变性处理。
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