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由于对cDNA文库一无所知,有很多疑问。
1.cDNA文库如果取一部分出来接种,那原始文库是不是就不完整了?
2.能将原始cDNA文库接种扩大培养吗?
请有经验的给点指导,谢谢!
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回复:时间:2021-08-21
You can do cDNA library amplification, but try to grow bacterial colonies on LB-agar plates. If you have to grow cDNA library bacterial cultures in LB liquid, grow less than 6 hours.
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回复:时间:2021-08-12
mparkYoucandoCDNAlibraryamplification,buttrytogrowbacterialcoloniesonLB-agarplates.IfyouhavetogrowcDNAlibrarybacterialculturesinLBliquid,growlessthan6hours.为什么要在平板上长,而不能直接像普通菌种一样液体过夜培养呢?我看了相关文库扩增的办法,也是先将含有10e6个克隆左右的文库用培养基稀释后涂布在平板上,待平板长好后,再用培养基洗下来。请问有什么蹊跷吗?
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回复:时间:2021-08-21
xyq641160不会不完整的,CDNa本身就是随机分布的,并且你听说过单拷贝mrna么?原来的cdna文库是实验室前人请公司构建的。我看了文库报告:总克隆数CFU=7.12×105cfu/ml×5ml=3.56×106我的理解是一共有5ml,总共有3.56e6的克隆。我的担心是:如果我吸了100微升出来扩大培养,也只有7.12e4克隆,而且这部分克隆分导致保存的cdna文库克隆减少。而且这7.12e4克隆里面不一定有我要的基因。不知道我的理解和担心是否正确呢?
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回复:时间:2021-08-22
你要扩基因的话,应该是race吧,哪用得了100u,1u就够用了,还有你吸出来的一般不会影响整个文库的,这样理解基因在文库中是均匀分布的,并不是随机分布,建议楼主好好提一次rna,好好分析一下失败原因
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回复:时间:2021-08-12
xyq641160你要扩基因的话,应该是race吧,哪用得了100u,1u就够用了,还有你吸出来的一般不会影响整个文库的,这样理解基因在文库中是均匀分布的,并不是随机分布,建议楼主好好提一次rna,好好分析一下失败原因1u是不是不行啊,根据文库报告,1u克隆数CFU=7.12×105cfu/mlx1u=712,这712个克隆里含有我需要基因的机率很小啊。
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回复:时间:2021-08-14
我之前做这个的时候也有这种情况,弥散在我看来有两种情况,第一,pcr程序设计的问题,Tm不合适,pcr轮数太高,解决方法是提高退火,适当减少循环。第二里面根本没有你想要的东西或者CDNa浓度太高,直接用原液pcr经常就会出这种结果
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回复:时间:2021-08-15
xyq641160老大,你们实验室有师兄师姐不,他们的论文看过没有还有race的说明书看过没,你对之后的实验有没有大致的概念,要怎样获得你的目的基因,用什么手段RACE已经成功了,就是全长拿不到。我们实验室刚刚开始做动物这一块,获取目的基因现在是瓶颈。
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