Reactionvolume100ul5ulNADPH(100mM)xulcellextractsoyouget50%conversion

0.2uMC14-TestosteroneaddTris-CitrateBufferpH6toanendvolumeof100ul

mixC14-TestosteroneandCitrateBufferandincubateitat37C

Incubatealltogether10minat37C

Stopreactionwith500ulMethylenchlorideVortex15secCentrifuge2minat13000rpm

TransferthelowerphaseintoanewtubeSpeedvac15min(mediumheat)Elutein20ulEthanol

Variations:-Differentvolumescellextractforfindingoutthe50%conversion-Differentconcentrationoftestosterone:byusing0.2uMC14testosteroneandcoldtestosterone.Inthatcasefillinfirstthecoldtestosteroneandspeedvac5mintogetridoftheethanol.-DifferentconcentrationofNADPH-DifferentpHofTris-CitrateBuffer

PreparationoftheChromatographystep:7,5mlAcetonaddMethylenchlorideto100mlmixandfillinthechromatographychamberstartaprerunwithwhatmanpaper

LoADIngofsilicaplatesMixsamplesandload10ulLetdryandloadtheother10ulPutsilicaplateinthechamberandletitrunfor45min.Afterrunningtakeitoutofthechamberandletdryandlayaphosphorscreenonit.Keepexposingfor2days.

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