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我用PCR扩增sgRNA文库oligo片段,胶回收,浓度约16ng/ul。载体用BsmBI酶切,55度过夜,胶回收,浓度19ng/ul。然后用T4连接酶22度连接1小时,电转2ul连接产物至感受态细胞,37度摇1小时,然后涂15cmLB板过夜。正常应该长至少一万克隆,可是我的板只有一两千。怎么办?挑了几个克隆做一代测序测不出信号。
我用感受态附带的质粒做了质控,可以长七八千克隆,说明感受态和电转程序都没有问题。用过NEB的Gibson连接酶,长的克隆反而更少。
做了两个多月一直是这样,急求帮助啊!能帮忙找到问题的可以有额外红包奖励~~谢谢了!
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回复:时间:2017-03-12
展开引用lavender_ting我用PCR扩增sgRNA文库oligo片段,胶回收,浓度约16ng/ul。载体用BsmBI酶切,55度过夜,胶回收,浓度19ng/ul。然后用T4连接酶22度连接1小时,电转2ul连接产物至感受态细胞,37度摇1小时,然后涂15cmLB板过夜。正常应该长至少一万克隆,可是我的板只有一两千。怎么办?挑了几个克隆做一代测序测不出信号。我用感受态附带的质粒做了质控,可以长七八千克隆,说明感受态和电转程序都没有问题。用过NEB的Gibson连接酶,长的克隆反而更少。做了两个多月一直是这样,急求帮助啊!能帮忙找到问题的可以有额外红包奖励~~谢谢了!......提几点小的建议,供参考:1.T4DNA连接酶进行16°C过夜连接;需要做一下对照,将酶切后的载体做一个自连的反应,同样操作,看一下会不会长克隆;2.连接产物使用Glycogen进行沉淀,用无菌水重悬后再电转;这样电转的效率会高一些。3.你的回收产物浓度都太低了,尽量多做一些,让浓度高一些;
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