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纯化非肌肉肌球蛋白实验一细胞匀浆
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| 实验材料 | 细胞 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 缓冲盐溶液二异丙基氟瞬酸匀浆缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 相差显微镜 |
| 实验步骤 | 1.准备下面的贮液和材料。 等渗的缓冲盐溶液（例如PBS，150mmol/LNaCl；10mmol/LNaPO4，pH7.2) 二异丙基氟瞬酸（DIFP） 1mol/L咪唑-HCl，pH7.0 0.5mmol/LK+EGTA，pH7.0 0.1mol/LK+ATP，pH7.0 0.1mol/LDTT NaN3 蛋白酶抑制剂 PMSF 抑胃酶肽A 亮抑酶肽 刀豆胰蛋白酶抑制剂 匀浆缓冲液： 0.34mol/L蔗糖 20mmol/L咪唑-HCl，pH7.0 5mmoI/LK+EGTA，pH7.0 5mmol/LK+ATP，pH7.0 5mmol/LDTT(干粉或用贮存液） 50μmol/LPMSF 3mmol/LNaN3 22μmol/L抑胃酶肽A 1.2μmol/L亮抑酶酞 10μmol/L刀豆胰蛋白酶抑制剂 PMSF可以用pAPMSF代替，它更稳定，但更贵。 2.洗细胞：轻轻地沉降细胞（例如3000g离心5分钟），去掉培养基，通过振摇打碎沉淀物，然后重悬于至少10倍体积冰冷的等渗缓冲盐水中。再次在新鲜的等渗缓冲盐水中沉降和重悬，总共3次。对于不同的细胞类型，离心力和时间应该进行优化。 3.最终的冰冷的细胞悬液中补加DIFP，使终浓度为5.7mmol/L（每毫升细胞悬液中加1μl）。冰浴5分钟。 4.上述的步骤2沉降细胞，然后重悬于4~6倍匀浆缓冲液中。 5.细胞匀浆要造成最大破坏，但要尽量减少氧化。 6.用相差显微镜检测细胞的裂解，证实超过99%都已经裂解了。 |
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