1. 抽提肌球蛋白时得到的沉淀物用 3 倍于沉淀物体积的肌球蛋白抽提溶液抽提 10 分钟。

肌球蛋白抽提溶液：

0.5 mol/L KCl

0.1 mol/L K2HPO4

2. 抽提物离心（GSA 转头，13000 r/min，17310 g）15 分钟，去掉上清。

3. 在肌肉残渣中加 1 L 冷的 dH2O，搅拌，然后用 1 mol/L Na2CO3 调 pH 到 8.2~8.5。

把混和物分到 6 个 250 ml 的瓶中，离心（GSA 转头，13000 r/min，17310 g）15 分钟离下含肌动蛋白的不溶物。

4. 去掉上清。然后如步骤 3 所述再次离心。倒掉上清并用合适的记号笔画出沉淀物的轮廊（这可以在以后的步骤中确定什么时候沉淀物开始涨大）。加足量冰冷的 dH2O 装满离心瓶以重悬沉淀物。大概重复 4 次直到沉淀物开始涨大。

5. 沉淀物一开始涨大，不管用水洗的次数是多少，都接着进行下个步骤。

6. 在 250 ml GSA 离心桶中用冰冷的丙酮重悬肌肉残渣，剧烈搅拌大约 20 分钟。

7. 离心（CSA 转头，13000 r/min，17310 g）沉淀 15 分钟并去掉上清。此外，沉淀可以在 Bounce 漏斗上过滤。

8. 重复步骤 6 和 7。

9. 把沉淀的蛋白铺在滤纸上（例如 Whatman 3MM ) 并让它在室温过夜干燥。

10. 第二天，如步骤 6 所述的那样，把干了的丙酮粉重悬在氯仿里并离心以去掉多余的脂肪。过滤并干燥沉淀。
1. 准备贮存液和材料

0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0

0.1 mol/L DTT（冻存在 -20℃，避免反复冻融）

0.1 mol/L CaCl2

0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

肌动蛋白解聚缓冲液（惯称冷缓冲液 A)：

2 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0

0.2 mmol/L ATP

0.5 mmol/L DTT

0.2 mmol/L CaCl2

该缓冲液可以配制成不含 CaCl2 的 50x 贮存液并冻存（-20℃ )。

2. 10 g 肌肉丙酮粉（用上文方法制备）和 200 ml 缓冲液 A 混合并在 0℃ 搅拌抽提 30 分钟。

3. 不溶的碎片离心（SS-34 转头，16000 r/min，19950 g）10 分钟。

4. 保留上清，0℃ 下在 20 ml 缓冲液 A 里重新抽提沉淀物 10 分钟。

5. 再次离心（步骤 3 )；把两次离心得到的上清混在一起并测量体积。

6. 边在烧杯里搅拌，边加适量体积的贮存溶液使抽提物中含 50 mmol/L KCI，2 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L ATP。

7. 在 4℃ 聚合 2 小时。

8. 在冰库放 90 分钟。

9. 边搅拌边使 KCl 浓度达到 0.6~0.8 mol/L 以去除原肌球蛋白。

10. 在冰库里缓慢搅拌 30 分钟。

纯化肌动蛋白丝

11. 超速离心（50Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时以沉降丝状的肌动蛋白。

12. 去掉上清并用含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 轻轻地洗沉淀的表面。为了去掉夹杂在肌动蛋白沉淀中的污染物，沉淀物在含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 中进行匀浆。超速离心（50 Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时以再次沉降肌动蛋白。

13. 超速离心管中挖出沉淀物并放到一个玻璃匀浆器中。最大限度地把丝状肌动蛋白从管子转移到匀浆器中，接着（例如在转移了沉淀物后）在每个管子中加 1 ml 缓冲液 A 并孵育 1 小时。收集在缓冲液 A 中残余的肌动蛋白，加到匀浆器中，另外再加缓冲液 A 使加入的缓冲液 A 总体积为 30 ml。用带紧的研杵的 Dounce 牌匀浆器在缓冲液 A 中分散沉淀物，然后把匀浆物加到直径 1 cm 的透析管中。

14. 透析 1.5 天，换 3 次缓冲液 A。在充分搅拌的溶液中，KCI 透析一半的时间大约是 5 分钟，所以额外多换几次液会有帮助。对肌动蛋白丝进行机械破坏也会加速肌动蛋白丝的解聚。

15. 超速离心（50Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时使 G-肌动蛋白溶液变清。

16. 测量肌动蛋白浓度。
1. 准备 2~8 mg/ml 溶在缓冲液 A 中的常规肌动蛋白。

2. 10 ml 常规的肌动蛋白上样到凝胶过滤柱（2.5cm x 50cm Sephadex G-150 柱，用缓冲液 A 平衡）。

3. 肌动蛋白样品进入凝胶后，上面加缓冲液 A，并且用 275 ml 缓冲液 A 跑柱子。

4. 以每管 5 ml 作分部收集。

5. 收集液通过 OD260 和 SDS-PAGE 检测肌动蛋白。
您知悉并同意，丁香通平台展示产品并非为平台自身产品，您发起询价或试用申请后，平台将会把您已提供或按要求提供的相关信息同步提供至所咨询的具体产品商家，由商家为您提供具体产品的价格咨询或产品试用注意事项及相关试用产品或完成相应购买，因此您知悉并授权平台将您的信息进行同步共享。您有权拒绝，但您知悉将无法参加询价或试用活动。