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单克隆抗体的纯化一蛋白A琼脂糖纯化
蚂蚁淘
/发布时间:1630949408 /浏览量:267
| 实验方法原理 | 葡萄球菌蛋白A可以结合数种哺乳类动物的免疫球蛋白。蛋白质A-琼脂糖介质可以结合部分IgM、大部分IgGl及几乎所有的IgG2a、IgG2b和IgG3MAb。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 腹水（单克隆抗体） 试剂、试剂盒 | 蛋白A-琼脂糖CL-4BTr1s缓冲液pH8.6柠檬酸盐缓冲液pH5.5乙酸盐缓冲液PH4.3甘氨酸•Cl缓冲液pH2.3中和缓冲液pH7.7 仪器、耗材 | 2.5cm玻璃层析柱紫外流通检测仪紫外分光光度计和石英比色杯超滤器及×M50超滤膜
实验步骤 | 1)将蛋白A-琼脂糖置于50倍体积的Tris缓冲液中充分溶胀。在室温下将其灌入直径为2.5cm玻璃层析柱中，用Tris缓冲液平衡。 10-20mL腹水中的抗体，可用干重大约为3g的蛋白A-琼脂糖纯化。 2)腹水液稀释于3倍体积的Tris缓冲液，以1-5mL/min的速度上样于蛋白A-琼脂糖柱，用Tris缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白质都被洗脱，采用A280监测流出液。 3)依次用2-3倍柱床体积的柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸•Cl缓冲液连续洗脱结合蛋白质，洗脱液直接接入装有中和缓冲液的管中。中和缓冲液的体积应为所收集液体积的1/4。 5)在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到1-5mg/mL，所用超滤膜为×M50。将单克隆抗体储存于-20℃。测定A280。以计算抗体浓度，鼠的IgG溶液1mg/mL=1.44吸光度单位。 注意事项 | 另一种缓冲液系统（由AmershamPharmac1aB1otech建议的）对于某些单克隆抗体具有更高的结合能力。这些备择的缓冲液如下所示: 甘氨酸-OH缓冲液（替换Tris缓冲液） 0.04mol/L柠檬酸钠/0.02mol/L氯化钠pH6.0及pH5.0(替换柠檬酸盐缓冲液） 0.04mol/L柠檬酸钠/0.02mol/L氯化钠pH4.0(替换乙酸盐缓冲液） 0.04mol/L柠檬酸钠/0.02mol/L氯化钠pH3.2(替换甘氨酸•Cl缓冲液） 其他 |
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