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含有目的基因真核表达 pEGFPC1载体的构建实验一质粒提取
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试剂、试剂盒 | 质粒提取试剂盒限制性核酸内切酶 |
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仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3mlLB(含有Amp或Kan)液体培养基中,37℃,225rpm培养12~16hrs。 2. 提取质粒 ⑴离心菌液,废弃上清。 ⑵加入250ulBufferP1,使菌片重悬,务必使片状物不可见。 ⑶加入250ulBufferP2,上下颠倒EP管4~6次,操作时间要少于5min。 ⑷加入350ulBufferN3,上下颠倒EP管4~6次,可见絮状沉淀。 ⑸离心13000rpm,10min。 ⑹离心后的上清液移入PrepSpinColumn。 ⑺13000rpm离心30~60Secs,弃滤液。 ⑻加入0.5mlBufferPB,13000rpm离心30~60Secs,弃滤液。 ⑼加入0.75mlBufferPE,13000rpm离心30~60Secs,弃滤液。 ⑽13000rpm再离心1min,弃滤液。 ⑾将PrepSpinColumn加到新的1.5mlEP管上。 ⑿加50ulBufferEB至滤膜中央,室温静置1min,13000rpm离心1min。即获得所需质粒。 3. 酶切鉴定 反应体系(20ul体系): ![]() 反应条件:37℃2-3hrs 4. 电泳:观察酶切结果。 |
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