组织标本

含有目的基因真核表达 pEGFPC1载体的构建实验一质粒提取

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试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3mlLB(含有Amp或Kan)液体培养基中,37℃,225rpm培养12~16hrs。
 
2. 提取质粒
 
⑴离心菌液,废弃上清。
 
⑵加入250ulBufferP1,使菌片重悬,务必使片状物不可见。
 
⑶加入250ulBufferP2,上下颠倒EP管4~6次,操作时间要少于5min。
 
⑷加入350ulBufferN3,上下颠倒EP管4~6次,可见絮状沉淀。
 
⑸离心13000rpm,10min。
 
⑹离心后的上清液移入PrepSpinColumn。
 
⑺13000rpm离心30~60Secs,弃滤液。
 
⑻加入0.5mlBufferPB,13000rpm离心30~60Secs,弃滤液。
 
⑼加入0.75mlBufferPE,13000rpm离心30~60Secs,弃滤液。
 
⑽13000rpm再离心1min,弃滤液。
 
⑾将PrepSpinColumn加到新的1.5mlEP管上。
 
⑿加50ulBufferEB至滤膜中央,室温静置1min,13000rpm离心1min。即获得所需质粒。
 
3. 酶切鉴定
 
反应体系(20ul体系):
 
 
反应条件:37℃2-3hrs
 
4. 电泳:观察酶切结果。
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