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混合淋巴细胞培养实验一混合淋巴细胞培养
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| 实验方法原理 | 两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此外双向混合淋巴细胞培养（twowayMLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（onewayMLC）。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 刺激细胞N23细胞系 |
| 试剂、试剂盒 | FCSRPMI1640培养基 |
| 仪器、耗材 | 细胞培养瓶培养板滴管吸管CO2孵箱超净台 |
| 实验步骤 | 1. 刺激细胞的准备 常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞（如N23细胞）或PBMC。 （1）取处于对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中。 （2）调整细胞数为1×106 /ml~2×106 /ml，移置于塑料培养瓶或者50ml离心管中。 （3）用60℃照射3000rad。 2. 反应细胞的准备 分离纯化待检个体的PBMC。 3. LC （1）按2×106PBMC与1×105经3000rad照射的N23细胞的比例，重悬于4ml10%FCSRPMI1640。 （2）放置于小培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4d内不要晃动。 （3）第5d加入1ml新鲜培养基。 4. 如要测定3H-TdR掺入率，一般可在MLC的第5d进行。 5. 如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞（CTL），一般在7~10d左右收获效应细胞。 |
| 注意事项 | 1. 注意无菌操作。 2. 刺激细胞接受照射剂量要准确，是细胞暂时存活，但失去增殖的能力。 3. 可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。 4. 不同刺激细胞与反应细胞的合适比例有所不同，应做预实验选择最佳的实验条件。 |
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