组织标本

细胞型操作实验一用两步基因置换法进行交配型转换

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实验材料
仪器、耗材
实验步骤
第1天

把菌株9-4和9-5在YPD平板上划单克隆,于30°C下培养。1、2、3、4组使用菌株9-4;5、6、7、8组使用菌株9-5。

第3天

上午,把菌株9-4和9-5的单菌落接种到5mlYPD培养液中,于30°C下培养。将YPD平板置于4°C下储存以备第13天使用。

第4天

按照「技术和方案1,酵母的高效转化」转化菌株9-4和9-5。从指导老师那里获得酶解质粒DNA,用pSCll转化菌株9-4,用pSC9转化菌株9-5。记住设置一个不含DNA的转化对照。每个转化液取200W涂于SC-um平板,在30°C下培养。不含DNA的转化对照同样操作。

第6天

把4个转化子在SC-ura平板上划单克隆,于30°C下培养。

第9天

将每个转化子的单菌落接种到5mlYPD,于30°C下培养。

第10天

使用血球计数板(附录G,用标准血球计数板进行酵母细胞计数)测定细胞密度,目无菌蒸馏水适当稀释。用每100ul体积含有105~106个细胞的菌液涂5-FOA平板。此平板将用于反筛选插入到MAT基因座重复区的URA3基因。通过同源重组,URA3基因的「突环」形成过程产生了5-FOAR。剩下的YPD培养物于4°C保存待第13天!用。

第13天

将每个转化子的9个5-FOAR菌落接到YPD平板(共36个)制备一块原平板,包亲本菌株9-4和9-5。(从第3天保存于4°C下的平板得到一个亲本菌株,另一亲本菌可从邻组得到。)从第9天培养的4个中间培养物中分别取1(^1点到原平板上,在30°C下培养此YPD平板。

第14天

用100ul菌株9-2涂于SD平板上(来自实验九A,第13天),使其干燥。用菌株9-3在另一块SD平板上重复这一过程。将原平板影印到SD平板上。每一个平板都用新的绒垫以防平板间的污染。同时将原平板影印到一个产孢平板和一个SC-mra平板上。

第16天

统计交配能力和在SC-ura平板上的生长情况。
第17天

统计孢子形成能力。

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