1.实验前准备

1.1材料

样品RNA：poly（A）^＋或总RNA，有义转录库对照

1.2试剂

SuperScriptcDNAkit（LifeTechologies）

T7T24引物

RNA酶抑制剂（LifeTechnologies或Ambion公司）

无RNA酶水（DEPC处理过的水，玻璃蒸馏）

25：24：1（V/V/V）酚：氯仿：异戊醇（分子生物学级）

7.5mol/L乙酸铵无水乙醇

无RNA酶的70％乙醇（预冷至-20℃）

10×转录缓冲液（Ambion）

10×rNTP混合液

100mmol/LDTT

10mmol/LBio－ll－CTP和Bioll－UTP（EnzoDiagnostics）

2500U/ulT7RNA聚合酶（Epicentre）

RNeasy小柱带RLT和RPE缓冲液及收集管（Qiagen）

5×片段化缓冲液

20×SSPE（Bio－Wh1ttaker）

0.5％（V/V）TritonX－100（分子生物学级；Sigma）溶于无RNA酶水

10mg/ml鲱精DNA（Promega）

500pmol/LBio948

20×反义转录库对照

6×SSPET：6×SSPE含有0.005％（V/V）TritonX－100

1.3耗材

热循环仪（例如Perkin－Elmer公司9600型PCR仪，带热盖）

0.1～10ul带滤芯枪头（Continental）

Lyophilizer（冻干机）

小薄壁PCR管

GeneChip（Affymetrix）

1～200ul带滤芯凝胶上样枪头（Fisher）

Rotisserie式摇床（AppropriateTechnicalResources）

50℃加热炉

2.在PCR仪上设定下列程序：

10min70℃

65min37℃（用总RNA时50℃）

150min15.8℃

无限4℃（保温）

3.用下列试剂为每个RNA样品配10ul第一链混合液，用带滤芯的枪头：

4ul5×第一链缓冲液

200pmolT7T24引物

1ulRNA酶抑制剂

1ul200U/ulSuperScriptⅡ逆转录酶

加无RNA酶的水至10ul

4.将每个RNA样品与有义转录库对照混合。每1ugpoly（A）^＋样品加5ul对照或每10～20总RNA加1ml对照。冷冻干燥至每管体积小于10ul，加无RNA酶的水至10ul。同时用手预热第一链混合液。

5.将每份RNA转移到小薄壁PCR管中，放进PCR仪，启动所设程序（第一步）。

6.70℃那步完成后，在温度降到37℃（或50℃）2min的时间里，加入预热（手中）的第一链混合液（每管10ul）。

7.在合适的反应温度继续保温60min。

8.每管配制130ul第二链反应混合液：

91ul无RNA酶的水

30ul5×第二链缓冲液

3ul10mmol/LdNTP

1ul10U/ulE.coli连接酶

1ul2U/ulE.coliRNA酶H

4ul10U/ulE.coliDNA聚合酶

这个混合液可以先配制，在冰上至多放置90min。

9.当PCR仪温度降到15.8℃时，每管加入130ul第二链反应混合液（总共150ul）。用枪头反复吸放混匀，在此温度下保温＞2h。

10.加入2ul5U/ul的T4DNA聚合酶继续保温5min。把样品转移到冰上。

11.加入150ul25：24：1的酸：氯仿：异戊醇，涡旋混匀，室温13000g离心5min。

12.小心地将水相转移到一个新的管子，不要吸到中间相。加入70ul7.5mol/L乙酸铵和0.5ml无水乙醇后混匀。室温13000g离心20min。

13.移去上清，沉淀用0.5ml冷（-20℃）70％乙醇洗涤，涡旋混合。

14.室温13000g离心10min。移去上清，沉淀空气晾干几分钟。

15.用25无RNA酶的水溶解cDNA沉淀并定量。

16.每种cDNA样品，按下面组分配制一个反应体系：

100ngcDNA

6ul10×转录缓冲液

6ul10×rNTP混合液

3ul100mmol/LDTT

2.4ul10mmol/LBio－ll－UTP

2.4ul10mmol/LBio－ll－CTP

2ulRNA酶抑制剂

2ul2500U/ulT7RNA聚合酶

无RNA酶的水配平到60ul

冰上可以放至多3h，用前升温到室温。

17.37℃保温8h至过夜。纯化前可以在-80℃放置至多48h。

18.加入无RNA酶水至100ul，加入350ulRLT缓冲液，混匀。加入250ul无水乙醇，混匀。

19.将每个样品上样到一个套进收集管内的RNeasy小柱上。台式离心机室温8000g以上离心15s。

20.将柱子转到新的收集管，加入500RPE缓冲液，台式离心机室温8000g以上离心15s。

21.弃去流出液，将柱子重新放入此收集管。加入500ulRPE缓冲液，台式离心机以最大速度离心2min。

22.把柱子转移到一个新收集管。加入50ul无RNA酶的水，8000g以上离心1min。重复此步骤。合并两次洗脱液。

23.在260nm用分光光度法测RNA的量。

24.取10体外转录的RNA用无RNA酶的水将体积配到24ul。加入6ul5×片段化缓冲液。小心混匀，在PCR仪上95℃温育35min。令其冷却到室温。-80℃可存放一年，用前37℃融化5min。

25.按下列组分为每个反应配170ul杂交反应母液：

51ul20×SSPE

1.7ul0.5％TritonX－100

1.7ul10mg/ml鲱精DNA

20ul500pmol/LBio948

10ul20×反义转录库对照

85.6ul无RNA酶的水

26.每份30ul片段化的转录RNA加入170ul杂交反应母液。在热循环仪上以99℃加热10min，再移到37℃放置5min以上。

27.微量离心机最大转速离心5min。

28.从GeneChip的上层隔膜插入一个带滤芯的枪头形成出气孔。从芯片的下层隔膜用带滤芯的上样枪头加入200ul杂交液。拿掉出气孔，用保鲜膜覆盖上下两层。

29.在rotisserie式旋转仪上以60r/min转速40℃保温过夜（16～18h）。

30.将芯片转入50℃加热炉，继续旋转芯片整整1h。

31.从炉内拿出芯片。从上层隔膜处插入带滤芯的枪头。

32.微量移液器按到底，将200ul上样枪头从下层隔膜间插入。垂直拿起芯片，缓慢抽出所有杂交液并放进微量离心管内保存于-20℃。

33.将芯片内充满6×SSPRET。

34.按厂商的说明书洗涤芯片并用藻红素染色。尽快扫描芯片。