胞内标记法

胞内蛋白的检测可以包括细胞分泌产物（如细胞因子）、组成结构（如微管蛋白）或细胞内整合产物(BrdU或病毒蛋白等）。就分泌产物而言，可以是某些形式的细胞激活研光。在这类实验中，可以使用蛋白质分泌阻断剂（如monensin或brefeldinA，均可从SigmaAldrich获得）使蛋白质不能分泌而在高尔基体中聚积，这有助于在设立实验时对抗体使用浓度的滴定以及证明抗体是否与正确的抗原结合。monensin处理过的细胞应未处理过的细胞荧光强度高[6]。此外，为了保证荧光标记的染色是胞内蛋白（而不是膜上蛋白），在细胞被固定前可用未标记荧光的抗体与之预先孵育以封闭细胞表面抗原。

对胞内染色的细胞首先要对细胞进行固定，并使细胞膜通透性增加。对固定的细胞增加膜通透性才能使标记抗体进入细胞与胞内蛋白结合。常用的固定剂是PBS溶解的多聚甲醛（paraformaldehyd)溶液，它能使蛋白质发生交联，但是这种固定方法可能会限制抗体识别抗原。固定剂的浓度范围为0.25%〜4%(w/V)。其他组织固定剂（如甲醇等）可能会使抗原结构改变从而影响抗体的染色，因为有些抗体识别的是抗原的构象表位。就增加细胞膜通透性的方法，含0.1%皂素（saponin)的平衡盐溶液就足以使抗体进入细胞。也可使用其他细胞膜渗透剂（如0.02%的Tween20)。由于这种细胞膜通透作用可以消失，有必要在所有溶液中加人皂素(包括染色和洗涤过程）。

使用荧光直接标记的单克隆抗体（与多克隆抗体的间接标记相比）能使抗体的非特异性结合的可能性减至最小，这也使研究者有可能使用同型对照从而进一步验证抗体结合的特异性。为了使样本保存的时间比隔夜保存更长，在细胞内染色完成后可将样本重悬于甲醛溶液中。

实验材料

甲醛[polysciences，Warrington，PA;cat.No.18814,不含甲醇，16(w/v]，用PBS1:4稀释，终浓度为4%(w/V)

PBS(PH7.2)

皂素缓冲液，0.1%(WV)皂素溶于含0.05%(w/V)NaN3的Hanks’平衡盐溶液。室温保存1个月稳定

Alexa488标记的抗胞内抗原的单克隆抗体

标记的同型对照抗体

时间

90〜120mm。

特殊设备

离心机

细胞计数设备

微量移液器（移液体积精确到10〜200ul和lOOOul)

流式细胞仪

实验步骤

在一些实验方案中，研究者可能希望同时标记胞内和胞外抗原。在这种情况下，首先标记胞外抗原，然后进行如下实验步骤（固定、增加膜通透性、胞内标记）。

(1)1500g•离心3min收获5X105个细胞，吸管吸弃上清。加人imlPBS，振荡混匀重悬细胞，获得单细胞悬液。

(2)加入Iml冰上预冷的4%甲醛固定液，室温孵育10min(每隔几分钟振荡混匀细胞，确保细胞为单细胞悬液）。

(3)1500g•离心3min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀。imiPBS重悬细胞沉淀。

(4)1500g•离心3min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀块。Iml皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(5)1500g离心3min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀。

(6)100^1皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(7)加人适量抗体（一抗或同种型）

(8)轻轻混匀试管，室温避光孵育30min。

(9)重复步骤(4)和（5)。

(10)加入ImlPBS，轻轻混匀，1500g离心3min。

(11)加入0•5mlPBS，轻轻混匀。

(12)流式细胞仪每个样本获得1〇〇〇〇个门内细胞。

结果

图13.7显示的是一个胞内染色流式细胞仪分析数据实例，其中x轴表示Alexa488焚光强度，^轴表示细胞数量，A图为阴性对照，B图为阳性标记的胞内抗原。直方图中显示的是用软件分析的一群相同细胞中阳性（信）细胞和阴性（噪）细胞的荧光强度均值。在标准化的流式细胞仪上（如本章中序言，仪器显示和质量控制中所述），仪器操作者应每天用已知MESF值的多个荧光强度的微珠校准仪器。这种情况下，微珠数应该与荧光染
料分子数量一致。这样直方图所绘出的MESF的相对值与仪器显示的荧光强度一致，呈线性关系。如果研究者想要定量测量荧光MESF值，首先要告诉操作者，在样本上机前，应将仪器设定在分析多种微珠荧光强度的设置，从而能得到样本的不同荧光强度。这类实验可能对研究者希望比较抗原表达水平有用（细胞内的和细胞外的），如不同时间的、动物与动物之间的治疗前后的抗原表达