相关文章
- 种子萌发与幼苗形成观察实验资讯
- 差减cDNA文库的建立实验
- 流式细胞术胞内染色实验方案| Abcam中文官网
- 布鲁克磁粒子成像小动物活体成像系统_布鲁克上海昔今实验仪器....
- DNA转化实验报告.doc
- Zeus Trading Sing Pte Ltd.进口数据...
- 武汉云克隆科技股份有限公司_李华渊_工商_风险信息 天眼查
- 罗美明四川大学化学学院 scu.edu.cn
- 血疟原虫(MP)薄血片检查法(手工法)
- 东莞市德聚胶接技术有限公司怎么样？ Jobui.com
- ...这个实验:地塞米松对蛋清诱发大鼠足跖肿的影响实验 实...
- SanktPeterburg – Wikipedia tiế...
促销商品
最新问答
- [08-10]药物临床试验申请书
- [07-22]中华医学会第九次全国病毒性肝炎慢性化、重症化基础与临床研究进展...
- [07-28]新药临床前研究内容有哪些方面
- [07-31]值得思考的多中心临床研究!
- [01-19]临床试验通常分为哪四期,各期的主要目的分别是什么？_
- [08-08]二期、三期临床试验和四期临床试验的区别都有什么?
- [08-13]消化内科论坛 专业医生社区,医学、药学、生命科学...
- [09-19]财税[2015]4号 财政部 国家税务总局关于创新药后续免费使用有关增值...
- [08-17]至幻剂
精选品牌
热卖商品
DNA测序一自动测序法
蚂蚁淘
/发布时间:1629912604 /浏览量:165
| 实验方法原理 | ABI PRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3"末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP6)和GeneScan胶(POP4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | PCR产物单链DNA质粒DNA 试剂、试剂盒 | 测序反应试剂盒去离子水三蒸水醋酸钠冰醋酸模板抑制试剂pGEM-3Zf(+)双链DNM13(-21)引物 仪器、耗材 | PCR管PCR仪测序胶全自动DNA测序仪高速离心机离心管移液枪枪头枪头盒
实验步骤 | 一、准备工作 2. pGEM-3Zf(+)双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4. DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6. 灭菌去离子水或三蒸水。 7. 0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。 8. 3mol/L醋酸钠(pH5.2) 称取40.8gNaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9. 70%乙醇和无水乙醇。 10. NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml3mol/LNaAc混匀，室温可保存1年。 11. POP6测序胶 ABI产品。 12. 模板抑制试剂(TSR) ABI产品。 13. 10×电泳缓冲液 ABI产品。 14. ABIPRISM310型全自动DNA测序仪。 15. 2400型或9600型PCR仪。 16. 台式冷冻高速离心机。 17. 台式高速离心机或袖珍离心机。 二、PCR测序反应 1. 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂： 所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDyeMix 1μl 1μl 待测的质粒DNA 1μl － pGEM-3Zf(+)双链DNA － 1μl 待测DNA的正向引物 1μl － M13(-21)引物 － 1μl 灭菌去离子水 2μl 2μl 总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。 2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。 三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物 1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5mlEP管中。 2. 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃离心30min，小心弃上清。 3. 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。 四、电泳前测序PCR产物的处理 1. 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。 2. 将溶液转移至盖体分离的0.2mlPCR管中，稍离心。 3. 在PCR仪上进行热变性(95℃2min)，冰中骤冷，待上机。 五、上机操作 1. 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。 2. 仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。 3. 电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。 4. 每一个样品电泳总时间为2.5h。 5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。 六、序列分析 仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。 七、仪器清洗 测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。 八、计算 1. 测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。 2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 注意事项 | 1. ABIPRISM310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。 2. 本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。 3. 作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。 4. 本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5)%，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。
================ 蚂蚁淘在线 ================ 免责声明：本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容 版权声明：未经蚂蚁淘在线授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘在线”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。 相关阅读
|
