基本方案抗IgM与LPS刺激的B细胞增殖

材料（带V项目见附录1)

纯化的静息B细胞（单元2.5)，采用Percoll梯度离心制备

VDMEM-10完全培养基

山羊抗IgM(JacksonImmunoresearch)或细菌LPS(E.Difco#011B4)

0.lmCi/ml溶于HBSS(附录1)的[³H]胸腺嘧啶（20Ci/mmol/L;DuPontNEN)

15ml聚丙燦管（Falcon)

96孔平底微孔板（Costar)

直接收集细胞到玻璃纤维板条的收集系统（PHDHarvester，CambridgeTechnologies)

备选方案1用8-巯基喹啉（8-MG)剌激B细胞多克隆活化

附加材料（见基本方案）

8-MG(Sigma)

0.Imol/LNaOH

2mol/LHCl

1.如果8-MG被作为唯一的B细胞激活剂，则采用位于50%与60%Percoll间纯化的B细胞，而非位于70%Percoll区带的静息B细胞（单元2.5)。

2.准备2mmol/L8-MG液体：将5mg8-MG(Sigma)溶解于0.3ml0•lmol/LNaOH，加入7.Oml含添加物的DMEM-IO并用2mol/LHCl(15M1)调节pH至7.0。

3.按基本方案步骤3单独将0.05ml2mmol/L8-MG或将其与抗Ig(0.5mmol/L终浓度）联合加入到96孔培养板中，每孔最终体积为0.2ml。

4.继续基本方案步骤4〜9。

备选方案2用蛋白激酶C激活剂及钙离子载体刺激B细胞多克隆活化

附加材料（见基本方案)

lmmol/L溶于乙醇的PMA与PDBU(Sigma)

10mmol/L溶于乙醇的indolactam(LCServices)

lmmol/L溶于乙醇的伊屋霉素（Calbiochem)

1.采用含添加物的DMEM-IO准备PKC激活剂与钙离子载体的工作液（每种设置三个稀释浓度）：

0.04〜4.Opmol/LPMA与PDBU

0.04〜4.Ojumol/Lindolactam

0.4〜4.Ommol/L伊屋霉素

2.按基本方案步骤3将50M1PKC激活剂与5〇4伊屋霉素按每一稀释浓度（来自步骤1)加入到96孔培养板（培养孔中终浓度为：PMA与PDBU，0.01〜1.0Mmol/L;
indolactam，0.01〜1.0jtxmol/L;伊屋霉素，0.1〜I.Ommol/L)

3.继续基本方案步骤4〜9。

备选方案3硫酸葡聚糖与poly(I:C)刺激B细胞多克隆活化

附加材料（见基本方案）

备选方案4细胞数量增加的定量

附加材料（其他材料见基本方案，带n/项目见附录1)

V磷酸缓冲盐（PBS)

用PBS制备的0.5mol/LEDTA(冰冷的）

冰冷的95%乙醇

lmmol/LHoechst33342(Sigma)

lmmol/L派洛宁Y(Sigma)

5ml圆底离心管（Falcon)

双激光流式细胞仪（如FACScan、BectonDickinson;单元4.2)