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我做的病毒的普通PCR结果还可以。我现在要做该病毒的定量。用的是ICycler定量PCR仪器。有那位高手能告诉我怎样操作该仪器。
我还要重新设计目的基因片段的因物吗?如果不用重新设计,那我下一步应该为做定量PCR做哪些准备呐?还需要设计参照模板吗?
这种实验的把握性有多大?
大家有什么更好的建议吗?
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回复:时间:2003-12-09
普通PCR结果毫不代表定量的也好。你是荧光全定量PCR吗?若是,那你的引物上要加上荧光素。大连宝生物提供该技术。但荧光素有好几种,要你自己根据引物选择。反正满复杂的,我当时很想做,查了很多书,也联系了大连宝生物经费不够,你准备10000元吧!
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回复:时间:2003-12-10
展开引用xuef_qi 我是定量PCR的新手,有很多问题要请教大家。我做的病毒的普通PCR结果还可以。我现在要做该病毒的定量。用的是ICycler定量PCR仪器。有那位高手能告诉我怎样操作该仪器。我还要重新设计目的基因片段的因物吗?如果不用重新设计,那我下一步应该为做定量PCR做哪些准备呐?还需要设计参照模板吗?这种实验的把握性有多大?大家有什么更好的建议吗?普通PCR结果还可以并不代表你的荧光PCR就可以开展,不知你的病毒是何种病毒?你用ICycler定量PCR仪器,你如果用Taqman技术,你必须设计引物和Taqman探针,不知你的ICycler定量PCR仪是否带有探针设计软件?如果绝对定量,你必须有定量标准品和内参照,本人经验,如果你是做课题,必须实验经费充足,仔细想想!Icycler的操作相对其它仪器复杂一些,你可以与我联系。但我感觉目前中国还没人做好绝对定量的,如果说有,那是骗人。......
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回复:时间:2003-12-11
首先你有多少经费,第二你什么时候毕业。如果经费充足时间不是太紧,可以试一下。如果你选荧光染料,如sybr green,还不是太贵,但是这种方法特异性不好。如果你用TAQMAN系统,需要荧光探针,这个东东比较贵,好的探针一个就好几千。你现在的产物多大,最好是在100-150左右,如果用SYBR GREEN,可以直接试一下你的引物。如果用TAQMAN,你还要看你的产物两个引物之间的区域还要能找到探针的结合区(也就是说这端序列能够满足探针设计要求),如果不行,你就要重新设计引物了。楼上的高手也说了,普通PCR好不一定定量PCR就好,即使你的引物能满足上面的条件,实际做起来,也会有问题。引物和探针都有了,而且都没有问题,就要优化你的反应体系。然后用标准品如质粒DNA作标准曲线。内参照一定要有,选好内参照后,同样的步骤从引物开始,直到作出标准曲线。这样就可以作样本了。
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