2021-08-10[求助]实时定量实验设计问题。急！

快到年关，才准备要做实时定量，但因从没做过，万一设计有误，那损失不堪设想，恳请各位高手帮我看看有没有什么问题：
我要检测的是一个巢氏PCR的终产物，那我能否用首次PCR的产物纯化，稀释后来作标准品？好象一般都认为用质粒作更好，但我想质粒片段与我样品首次PCR产物的长度不同，扩增效率是不是也有差异？而且用质粒扩增前，是不是要先把质粒酶切成线性后，才能扩？（这个问题好象有点菜）
另外，如果用荧光染料，那是用预混型试剂好，还是各配各的好？因为据说镁离子浓度对实验影响较大，如果用预混型，不是就不能调离子浓度了吗？

先谢谢各位了。