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回复:时间:2017-10-12
RNA 定量的程序很多, 比较用了Ribogree,Agilent BioAnalyser,spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此,我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。RNA 质量RNA 质量主要包括RNA的纯度(没有蛋白质和DNA的污染)以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法,它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱,通过图谱来反应RNA的量和完整性,其完整性通过完整性系数(RIN)来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA,4代表没有完整的rRNA带。由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性,因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法:采用GAPDH的3’:5’分析法。我们使用oligo dT进行逆转录,然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性,如果高于5说明降解。QRT-PCR抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。抑制物的来源:生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物,盐离子,尿素,血红素,heparin以及IgG.是否有抑制物的评价体系:1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3.用细菌检测临床样品的抑制4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1.RT和PCR单一酶系统2.RT和PCR分离的酶系统3.RNA逆转录引物的选择引物主要有三种:1.随机引物:随机引物,特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果,建议使用15nt的随机引物.2.oligo-dT:只能用于mRNA完整的样品,特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难3.特异引物:最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
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