定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-timePolymeraseChainReaction，简称Real-timePCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitativerealtimepolymerasechainreaction，简称Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法技术，有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。

• 中文名

• 定量PCR

• 外文名

• PolymeraseChainReaction

• 类型：

• 外参法终产物分析

• 别称

• 定量PCR技术

1. 1名词定义

2. ▪广义概念

3. ▪狭义概念

1. 2检测模式

2. 3组成步骤

3. 4关键点

1. 5质量评价

2. 6优化

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

1.外参法终产物分析　所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

2.内参法终产物分析　所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

3.外标法过程监测　这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。

4.内参法过程监测　由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。

5.外标法过程监测内对照　这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。　PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式，见下面检测模式的内容。

狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。

PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：

⑴RGreenI检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。

⑵解探针模式（Taqman）HydrolysisProbe。温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。

⑶杂交探针（HybridizationProbes）模式。温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。

RT-qPCR是由三个步骤组成：

1.反转录：依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA;

2.扩增：用PCR的方法扩增cDNA;

3.检测：实时检测和定量扩增的产物.

RT-qRCR影响分析可靠性关键点（Keypoint):

1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计

2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性

3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题

由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：

1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品

2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞

3.总RNA或者mRNA

4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略

5.不同的酶以及酶的不同组合

6.变异系数、灵敏度

7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。

8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。

RNA定量的程序很多，比较用了Ribogree,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。

RNA质量

RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28SrRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。

由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。

我们使用oligodT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’；5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’；5’的比值在1，反应较高度完整性，如果高于5说明降解。

QRT-PCR抑制物的组成

QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。

抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.

是否有抑制物的评价体系：

1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测

2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况

3.用细菌检测临床样品的抑制

4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况

反转录反应系统

1.RT和PCR单一酶系统

2.RT和PCR分离的酶系统

3.RNA逆转录引物的选择

引物主要有三种：

1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.

2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA.而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难

3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。

PCR优化主要有：

1.引物的浓度

2.建议使用SYBRGreenI和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试

RealTimePCR操作流程

操作流程：

I．靶的选择和试验设计

1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断

查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物，探针以及反应条件.

如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考，以下的设计方案仅供参考：

A.最广泛使用的商业化的软件C.如果BeaconDesigner无法得到您说需要的结果，或者获得到设计方案的备选数目不够的话，可以选择的服务方案，详细周到

D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序：您可以挑选其中的4-6对引物进行试验，选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对，并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR

引物设计简介

DNA引物长度：15-25个碱基

GC含量：50%左右

如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争，分之内杂交，倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的△G为负值，即：