DNA聚合酶

2009-03-16【求助】PCR中的DNA聚合酶和载体的选择问题,希望大家帮忙

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我要P一个3kb左右的目的基因,需要一个保真性高的酶,因为后面要测序,而且我的两个引物的GC含量相差也很大,还需要一个载体连接去进行筛选,这个载体要4kb以上的,因为要和我的目的基因大小相差大一点的,而且这个载体上还要有多个切割位点,好让我切割下来,与最终的质粒相连。
最近,我看了很多这方面的资料,但是我对这个方面不是很了解,所以现在搞得头昏眼花的,不知道该选什么酶和载体,希望大家多多帮忙
在此十分感谢
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回复:时间:2009-03-27

用Pfu高保真酶扩增!载体选择PcDNA3.1

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回复:时间:2009-03-27

谢谢,你的帮忙,我十分感谢,不过我稍微查了一下你说的载体,好像是5000多,我们老师不会给我买的,能给我推荐一个便宜一些的吗,300、500的,十分感谢,无限感激

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回复:时间:2009-03-22

希望大家帮忙啊!!!我的平端载体应该选哪个啊

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回复:时间:2009-03-18

我们有top克隆平端载体,需要请联系我

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回复:时间:2009-03-19

如果有条件最好用 PrimeSTAR GXL 如果没有那个条件可以用Prime STAR HS如果GC含量高可以用Prime STAR HS with GC buffer

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回复:时间:2009-03-18

Prime STAR HS with GC buffer 真的很好用吗,我正在考虑呢

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回复:时间:2009-03-27

如果从费用角度来考虑 LA taq with GC buffer 是非常好的。一般做5‘RACE我都用这个,LA Taq配GC buffer I 基本无敌,但是有的时候会有个别碱基错配。prime STAR的扩增效率能低一点,保真效果好,这个看实际情况决定。

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回复:时间:2009-03-21

谢谢楼上的朋友,我的基因要去测序,要有保真性,呵呵,我想问问这prime STAR对于引物有没有要求啊,要求引物磷酸化吗??期待回来。。。。。。。。。。。。。。。。。。

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回复:时间:2009-03-20

引物没有特殊要求,一般的PCR级别引物就可以。以下是说明书:http://www.takara.com.cn/explain/E/DR010A.pdfhttp://www.takara.com.cn/explain/E/DR044A.pdf需要注意的是这个酶是HS版本的,在PCR程序设定时最好在前面先加一步94度3分,这个说明书上没有提到,本人一般使用其中的2 step PCR反应条件。

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回复:时间:2009-03-18

楼上的jk_xdx 十分感谢你的提醒,要不然我要走很多的弯路呢,好人好梦呵呵