1. 放射性标记DNA片段的3’末端，含5’凸出端的DNA片段及浓度为1~2μmol/l的适当［α-32P］dNTP，在11℃温育20min。

 

2. 选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端，即所谓的“置换合成”。双链DNA片段在dNTP存在下与T4聚合酶温育，其3’末瑞的外切酶活性导致从3’末端降解DNA，当补加4种dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA镆板的3’末端。在T4DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液，可获得最隹标记效果。

3. 变双链DNA的粘性末端成平端，便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下，酶促的降解终止于双链区，类似地，如果末端存在5‘凸出，酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中，DNA与T4DNA聚合酶和浓度各100μmol/ldNTP在温育20min。