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用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3’端
mayitao
/发布时间:1547839436 /浏览量:28
| 实验材料 | 限制性内切核酸酶大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段模板DNA 试剂、试剂盒 | 乙酸铵乙醇dNTP溶液 仪器、耗材 | SephadexG-50离心柱水浴
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 乙酸铵（10mol/L) 乙醇 2.酶和缓冲液 适宜的限制性内切核酸酶 大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段 3.核酸和寡核苷酸 含适当未标记的dNTP各1mmol/L的dNTP溶液 模板DNA(0.1~5μg) 4.放射性复合物 [α-32P]dNTP(10mCi/ml，比活性为800~3000Ci/mmol） 5.专用设备 SephadexG-50离心柱，用TE(pH7.6)平衡 预先设定至75℃的水浴 二、方法 1.在25~50μl的适当的限制酶缓冲液内，用所需限制酶消化高达5μg模板DNA。 2.向完成的限制酶消化反应中，加入： 10mCi/ml[α-32P]dNTP （比活性800~3000Ci/mmol） 2~50μCi 未标记的dNTP 至终浓度为100μmol/L Klenow片段 1~5单位 室温温育反应15min。 3.于75℃加热10min以终止反应。 4.用SephadexG-50离心柱层析分离放射性标记的DNA与未掺入的dNTP或在2.5mol/L乙酸铵存在下进行两轮乙醇沉淀。     
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