耐药质粒DNA转化实验　　本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆，即转化子。　　　　【原理】　　受体菌EcoliRRI在低温条件下经Ca++处理，可改变细胞膜的通透性，利于受体菌对DNA的摄取，这种经Ca++处理的细菌称感受态菌。pBR322质粒带有氨基苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）基因，如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的EcoliRRI菌体内，则可使该细菌获得Apr和Tcr，表现出对Ap和Tc的抗药性。　　（一）感受态菌的制备　　【材料】　　1．菌株E.coliRRI　　2．LB液体培养基　　3．75mMCacl2　　4．其它：灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机　　【方法】　　1．将细菌接种于5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养16~20h。　　2．取新鲜菌液，按1/100的接种量接种于LB培养基中，37℃振荡培养2~3h。　　3．取1.5ml菌液，4℃3000rpm/min,离心5min，弃上清。　　4．菌体沉淀加入750μl预冷的（4℃）75mmol/LCaCL2溶液，轻轻吹打菌悬液，放冰浴30min。　　5．4℃3000rpm/min,离心5min，弃上清。　　6．菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCL2溶液，冰浴4min以上。4℃保存备用。　　（二）质粒转化　　【材料】　　1．pBR322质粒DNA,　　2．感受态菌75mmolCaCl2　　3．LB肉汤培养基，无药LB琼脂平板，氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）　　4．其它：灭菌小试管，L形玻璃棒　　【方法】　　1.取2个洁净，灭菌的EP管，按表10－2加入各成分：　　　　　　　2.上述2个试管充分混均匀后，置冰浴30min。3.42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。4.加入1mlLB肉汤培养基，37℃静止培养1h。　　（三）转化子筛选：　　1．取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）上，对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上，每块板涂0.1ml，用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置370C培养过夜，观察转化结果。　　2．E.coli受体菌不含有质粒DNA，也不含Apr和Tcr。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落，可初步确定受体菌获得了耐药性质粒，然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。

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