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农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
制备转化用的农杆菌菌液准备:1.灭菌试管400毫升细长烧杯2瓶,离心瓶4-6个(250ml)。2.试剂:YEP1200ml(每瓶300ml共4瓶)+Kan1;1000,Rif1:500。1/2MS+2%蔗糖(灭菌115度20分钟),Silwet在-20℃贮存。3.步骤:共转化农杆菌:于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul:10ml接种。28℃,3000rpm摇过夜,约30小时,次日下午6点将已摇活的菌按(1:400)及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃,300rpm约14小时,次日上午8点测OD值,用YEP+Rif作为空白对照,当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时,可收集菌体于250ml离心瓶(灭菌),4℃,4000g离心10min。用10%蔗糖(含0.02%silwet)稀释至OD600约为0.8--1.0左右即,用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右,于弱光下生长。4.浇水:转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。(注意:选取上述配好的溶液2ml,充分打碎管底部的菌体,在将混匀的菌体溶入600ml溶液中,混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%)。2.先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉,再用宽胶带把花盆的土封好。3.转化的准备工作:2个400细长烧杯,宽胶带,记号笔,表等。4.转化过程略,视苗的长势弱0.8Pa3`,长势好的0.8Pa5`。5.标记好,将转化好的苗平放于盒子内,上盖封口膜封好,避光培养24hrs2天后,将植株立起正常培养,浇水,3天1次。
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