相关文章
促销商品
最新问答
- [10-03]国内能买到的快速高效提取人DNA试剂盒有哪些? 夏忆 的回答
- [03-14]哪家公司的DNA提取试剂盒质量比较好?
- [07-24]动物组织DNA提取方法
- [07-28]求助动物组织的DNA提取试剂盒 00问答网
- [12-14]【求助】求助病毒DNA的提取
- [10-03]什么是TENP溶液,它的作用是什么？它是用在微生物DNA的提取过程...
- [07-25]CTAB提取植物DNA的方法及各试剂的作用.doc
- [10-03]常规DNA纯化试剂盒(PCR产物,酶切产物)50T_价格厂家供应商_...
- [07-26][求助]大家能推荐好一点的DNA提取试剂盒吗？ 经验共享 分析测试...
精选品牌
热卖商品
阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA
蚂蚁淘
/发布时间:1628703001 /浏览量:235
| 实验方法原理 | 从琼脂糖凝胶中回收的DNA片段，如PCR产物或酶切DNA片段，对进一步酶切具有一定的抗性。这种抗性产生的原因是多方面的，通常将其归为抑制剂的存在。经带正电荷的离子交换树脂纯化的双链DNA可有效去除样品中的抑制剂。在低离子强度的缓冲液中，带负电的DNA结合到带正电的基质上，如DEAE-Sephacel或DEAE-Sephadex，污染物被洗脱，然后通过提高缓冲液的离子强度，将DNA从基质上洗脱下来。由于质粒DNA以及单链DNA-经与基质结合很难洗脱，因此不宜采用DEAE树脂纯化。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | DNA样品 试剂、试剂盒 | 乙醇异丙醇酚氯仿TE 仪器、耗材 | 一次性小柱子或2ml注射器树脂、预溶胀的DEAE-纤维素或DEAE-Sephacel
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 乙醇 异丙醇 酚：氯仿（1:1,V/V) TE(pH7.6) TE(pH7.6)含0.1mol/LNaCl TE(pH7.6)含0.2mol/LNaCl TE(pH7.6)含0.3mol/LNaCl TE(pH7.6)含0.6mol/LNaCl 2.核酸与寡核苷酸 DNA样品应溶于TE(pH7.6)中 3.专用设备 一次性小柱子或2ml注射器 树脂、预溶胀的DEAE-纤维素或DEAE-Sephacel 二、方法 1.DEAE悬浮在20倍体积含0.6mol/LNaCl的TE(pH7.6)中。待树脂沉降后，吸去上清。再加20倍体积含0.6mol/LNaCl的TE(pH7.6)，轻轻地将树脂重新悬浮起来。树脂重新沉降后，吸去大部分上清液。平衡后的树脂可于4℃保存。 2.取0.6ml（足以结合20μgDNA)的DEAE悬浮液装一小柱或2ml注射器针筒。 3.分别用下述溶液洗柱： 0.6mol/LNaCl的TE(pH7.6)3ml，TE(pH7.6)3ml，0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)3ml。 4.将DNA(溶于pH7.6的TE中）与等体积含0.2mol/LNaCl的TE(pH7.6)混合，混合液上样到层析柱上，收集流出液重新上柱。 5.1.5ml含0.3mol/LNaCl的TE(pH7.6)洗柱2次。 6.0.5ml含0.6mol/LNaCl的TE(pH7.6)洗脱DNA,共3次。 7.用酚:氯仿抽提洗脱液1次。 8.将水相等体积的分装在两个微量离心管中，每管加等体积的异丙醇，室温放置15min,于4℃最大转速离心10min回收DNA。 9.用70%乙醇小心清洗沉淀，将离心管口打开，置操作台上数分钟使乙醇挥发。然后将DNA重溶于小体积（3~5μl)TE(pH7.6)中。 10.通过聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳对DNA片段进行定性和定量。 (1)将少量（估计含有20ng)最终制备的DNA片段与10μlTE(pH8.0)混合，加2μl所需的凝胶载样缓冲液。 (2)加样并在适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原DNA作为标准参照物。分离的DNA片段应与限制酶消化物中的正确片段同步迁移。 (3)仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带的存在表明有DNA污染。通过分离片段与标准参照物的相对荧光强度，常可估计最终制品中的DNA量。 极少数情况下，回收的DNA还需作进一步纯化。最好的方法是再次采用DEAE-Sephacel层析法或采用不同厂家提供的特异性树脂。很多树脂都是预先制成一个小柱子，适合用微量离心机来纯化少置的DNA。与环状质粒DNA相比，树脂更宜于纯化线状DNA分子。
================ 蚂蚁淘在线 ================ 免责声明：本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容 版权声明：未经蚂蚁淘在线授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘在线”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。 相关阅读
|
