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DNA Plasmid Prep.
DNAPlasmidPrep.
ThisisascaledupversionoftheBaronprotocolwhichhasbeenmodifiedtoachievepuritycomparabletoCsClpreps.IhavenotsortedoutstrainvariationsyetbutHB101workswell.
Solutions
SolutionI
1%glucose10gglucose
25mMTrispH8.025ml1MTrispH8.0
10mMEDTA20ml0.5MEDTApH8.0
upto1literwithQ
storeat4o
SolutionII
1%SDS2.5ml20%SDS
0.2NNaOH1.0ml10NNaOH
upto50mlwithQ
makefreshasneeded
SolutionIII
25%potassiumacetate250gpotassiumacetate
add150mlglacialaceticacidandbringupto1liter
withQ
storeat4o
PEG8000
40%PEG8,00040gPEG8,000
upto100mlwithQ
storeatroomtemperature
Procedure
•Spindown5mlofaovernightculturein3Eppendorftubesat14KandpoolthesamplesbyresUSPendingin200mlSolutionIcontaining1mg/mlLysozyme(Sigma#L6876)onice.
•Immediatelyadd400mlSolutionII,followedby300mlSolutionIIIandspinat14Kfor5-10".
•Followingthespin,remove600-700mlofthesupernatantandadd500mlphenol/chloroform;mixandspinat14Kfor5".
•Remove600mlsupernatant,topoffwithcoldEtOHandspin10"atroomtemperature.
•Washwith80%EtOH,dryandresuspendin60mlTEplus1mlRNaseA(10mg/ml);incubateat37°for10".
•Add50mlphenol/chloroformandspinfor2",remove50mlsupernatantandadd10ml5MNaClplus21ml40%PEG8000.
•Incubateonice5",spin5"atroomtemperatureandresuspendin90mlQ(forpUCoriIgetapprox.0.2-0.5mg/ml).
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