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1细胞用冷PBS洗两遍,离心,去除上清;
2加50~100ul三去污细胞裂解液;
3加PMSF,AP各1ul;
4用100ulTIp头吹打数次;
5置冰上15分钟
612000rpm,15min,4度
7取上清。这时,上清呈黏液状,用枪头吸时会将细胞碎片一起吸出。拉丝度很长,测蛋白浓度显示有,各位,这是怎么回事?做WB会影响结果吗?这种蛋白质在保存过程中会容易降解吗?
有的资料上显示第四步,不是用Tip头吹打,而是将EP管在桌上猛敲击几下,这个方法我也试过,但是结果蛋白浓度很低,没有出现上述现象,这是怎么回事呀?
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回复:时间:2004-07-02
应该是DNA之类的东西了,不影响WB结果的,但溶液中核酸含量过多可能会影响蛋白定量,比如用OD280的值来测蛋白就不准确,如果提取的蛋白无需定量也就没什么问题了第二个问题,我猜是细胞没有充分裂解,也许单靠敲打无法充分悬浮细胞,所以溶液中既没有DNA成分,蛋白浓度也低,所以还是吹打为好仅供参考,你可以用几种方法都试试看WB
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