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培养细胞染色体显示法实验一传代培养细胞染色体显示法
实验方法原理 | 培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和制出标本清晰度高等优点,是制备染色体极好的对象。 | ||||||||
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实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | HanksNaHCO3培养基血清秋水仙素 仪器、耗材 | 酒精灯镊子培养瓶吸管离心管
实验步骤 | 1. 培养细胞 取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%~90%汇合单层培养细胞; 2. 加秋水仙素 使用最终浓度为0.02~0.8μg/ml营养液;温箱继续培养6~10 小时; 或用低温封闭法:把培养细胞置于4℃条件下6~12小时后,再于37℃温箱中继续培养6~10小时处理(加秋水仙素); 3. 采集分裂细胞 可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右反复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面反复冲涮;应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落;注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观察; 4. 离心 收集培养液,1000转/分钟,离心5~10分钟; 5. 低渗处理 吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液,在温箱中静置20~30分钟; 6. 预固定 向悬液中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打调匀;此措施能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块; 7. 固定 离心,同4,吸除上清液,加新鲜固定剂5~10ml;加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置15~20分钟; 8. 重复7,末次离心后,小心吸除大部上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0.5~1ml; 9. 制片 用滴片法制片,按如下步骤:彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储存备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1张,在载物片表面出现细微水气时,立即向片的一侧滴2~3滴细胞悬液(如固定液不散,可能因载物片未洗净或不冷所致),滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用(做显带或荧光观察等)或立即进行染色观察; 10. 染色和封片 一般常用Giemsa染色;取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直接观察(适用油浸镜);如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片(或先迅速过丙酮两次,每次30秒)后,再过二甲苯,然后封片亦可。 ![]() 其他 | 一、讨论 1. 染色体制备过程是既易又难的方法;易在要求条件简单、操作不复杂繁锁,易于获得结果。 2. 难在制备出的标本不总是非常理想和一致,常出现分裂相数少、染色体分散不良、或染色体过短等,为此在初做时,应试做预试验,摸清诸条件,能提高成功率。
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