1.Transferfixedembryostomicrofugetubes.Allowtosettlefor10minutes.Gentlyremovemostoftheliquid.

2.Add100ulantibodytoonetubeand100ul1%normalgoatserumtotheotherasacontrol.Letsitfor45minutesatroomtemperature.Embryoswillsettle.

3.Removemostofliquid.Add1mlSWtowash.Allowtosettle,removeliquid.

4.Add100ulFluorescein-orTexasred-congugatedanti-mouseIgG(diltutedaccordingtomanufacturer"srecommendations)tobothtubes.Letsitfor45minutesatroomtemperature.Embryoswillsettle.

5.Removemostofliquid.Add1mlSWtowash.Allowtosettle,removeliquid.Add100ulPBS.

6.Transfer10ulofeachsampletomicroscopeslides.Checkthatthereareembryos.Coverslip.Examineusingepifluorescence.

AntibodiesfromDavidMcClay

Ig8,1D5-PMCsandspicules

EctoV,295-ventralectoderm

5C7-vegetalplateandposteriorarchenteron

Secondaryantibody

TexasRed-congugatedGoatanti-mouseIgGfromJacksonImmunoResearch(1/100)

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