第一阶段 用荧光染料标记蛋白质

材料

缓冲液和溶液
将储备溶液稀释到适当的浓度。

用NaOH调节的N-二羟乙基甘氨酸（0.1mol/L,PH7.5)

用NaOH调节的N-二羟乙基甘氨酸（1mol/L,pH9.0~9.5)

消化缓冲液
20mmol/L磷酸钠
10mmol/LEDTA
20mmol/L半胱氨酸/HCl缓冲液（pH7.0)

N,N-二甲基甲酰胺（DMF)
在存储容器中加入约1/3体积的吸湿性树脂用于干燥DMF。例如，可以始终将AG501-X8混合床树脂(Bio-Rad)放在DMF原料瓶中。如果对DMF的完整性有任何疑问时，则可以另外加入一些新鲜树脂，或者用新鲜树脂替换老树脂。这样的操作是考虑到会出现标记蛋白质能否达到期望比例的问题，因为标记反应时水的存在（可能来源于DMF)会竞争游离染料。

含有10mmol/LEDTA(pH7.0)的磷酸钠（20mmol/L)

磷酸盐缓冲溶液（PBS)

TE(pH7.0)

酶和缓冲液

固定在琼脂糖顆粒上的木瓜蛋白酶（分散在消化缓冲液中的50%混悬液；Sigma)

标记化合物

Cy3和Cy5OSu单功能硫代吲哚花菁琥珀酰亚胺酯（Amersham)
硫代吲哚花菁（cy)的琥珀酰亚胺酯染料共价结合到游离氨基（赖氨酸侧链α-氨基末端或e-氨基）。Cy染料以冻干态使用，所有情況下保证其处于干燥状态以避免与水反应。由于批与批之间可能存在差异，每一瓶中染料的量必须单独测定。在这里所举的例子中，用俄勒冈绿的琥珀酰亚胺酯（分子探针）来标记MC5PKCα抗体。

抗体
待标记的纯化抗体，如MC5(单克隆）或T250(多克隆），或蛋白质标记反应必须在没有氨基的缓冲液中进行。许多商用抗体制品中添加了含有可能竞争Cy染料的游离氨基添加剂（如牛血清白蛋白或明胶）。也有许多供应商可以根据要求提供不含这些化合物的抗体制品，这种情况下可以要求提供溶于磷酸盐缓冲溶液中、浓度为lmg/ml的样品。

凝胶

SDS-聚丙烯酰胺凝胶
制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白时，请参考附录8

专用装置

Centricon浓缩器：YM10,YM30,YM100(分别切割10、30、100kDa大小的分子；Amicon)

凝胶过滤/分子大小排阻色谱柱（预装一次性Econo-Pac10DG;Bio-Rad)

蛋白A-琼脂糖凝胶柱（Econo-Pac的2ml柱；Bio-Rad)
用装料体积20倍的20mmol/L磷酸钠冲洗柱来使柱平衡。推荐用蛋白G来纯化小鼠抗体。

UV/可见吸收分光光度计

附加试剂

本方案中的第7步需要测定蛋白质浓度的试剂（如Bradford分析试剂）（Spectoretal.1998，第56章）。

方法

Fab片段的制备与纯化

1.采用像CentriconYM100的一次性浓缩器，以离心的方法使抗体在含10mmol/LEDTA的20mmol/L磷酸钠溶液（pH7.0)中的浓度浓缩至15~20mg/ml。

2.向250ul浓缩的抗体制品（约4~5mg)中加入500ul消化缓冲液和500ul固定在琼脂糖顆粒上的50%木瓜蛋白酶混悬液（分散在消化缓冲液中）。37°C振摇（振荡孵化器中，300~400r/min)6~10h进行消化。
重要：消化过度（如超过16h)将导致Fab片段裂解成较小的多肽。因此建议进行预试验，毎隔1h取少量的消化液（约5ul)采用还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分桁，在还原条件下，lgG的重链和轻链会像50kDa和25kDa的多肽一样迁移。经木瓜蛋白酶消化的抗体按约25kDa大小的分子迁移。

3.采用蛋白质A-琼脂糖凝胶柱从Fc部分和未经消化的抗体中纯化Fab片段。将消化混合物加到平衡过的柱上，并按每份1ml立即开始收集流过液部分。
蛋白A将与抗体的Fc部分结合，因此可以从消化混合物中除去全抗体和Fc部分，获得的流过液就仅仅含有Fab片段。注意！IgG分子的许多亚类不与蛋白A结合。当需要制备小鼠单克隆抗体的Fab片段时，使用蛋白G。

4.为了鉴定哪些流过液部分中含有纯化的Fab片段，测定每一部分的OD₂₈₀,收集并合并Fab浓度最高的三个或四个组分。
一般来讲，可以在大约3~4个组分中发现Fab片段。

5.使用CentriconYM100柱（截流值10kDa;Amicon)离心将合并的组分浓缩至体积0.5ml以下。

6.将样品加到PBS平衡的低分子质量（6kDa以下）凝胶滤过层析柱上，用PBS洗脱Fab片段（按照产品说明进行)。
为了标记Fab片段，必须将它们交换到不含游离氨基（如消化液中必须除去游离半胱氨酸）的缓冲液中。

7.洗脱后，采用Centricon浓缩器使Fab片段浓缩后，测定蛋白质浓度。加入1/10体积的1mol/LN-二羟乙基甘氨酸（pH9.0)
采用Bradford分析法测定IgG浓度，以牛血淸白蛋白作为标准品，并乘以系数2。
浓缩的Fab制品现在就可以准备进行荧光硫代吲哚花菁染料标记。

染料制备

8.将各瓶冻干染料中的内容物重新混悬于20ul的干N,N-二甲基甲酰胺中，得到浓度约10mmol/L的Cy溶液。

9.将1ul染料混合物用PBS按1:10000稀释，并由可见吸收峰计算染料浓度。
Cy3和Cy5在554nm和650nm的吸光系数分别为150000L•nmol^-1和250000L•nmol^-1。

染料结合

10.标记蛋白质时，将其混悬于不含游离氨基的缓冲液中。如果蛋白质溶液不是在一种适当的缓冲液中，则按上述第6~7步进行操作。
蛋白质如果因稳定性的考虑必须采用持定的缓冲系统，则凝胶过滤系统也采用该缓冲液平衡。注意缓冲成分中不应含有游离氨基或抑制标记反应的成分。值得注意的是，像二硫苏糖醇、β-疏基乙醇等还原剂对标记反应有干扰。然而，如果为了保持生理/蛋白质功能而必须添加还原剂时，β-疏基乙醇因为干扰较低，因此是首选的还原剂。在0.1mol/LN-二羟乙基甘氨酸（PH9.0)中进行标记以前，T(P)250和MC5均需置换到PBS中。
建议在标记反应过程中保持碱性pH条作（同时保持蛋白质的完整性），以便使赖氨酸的ε-氨基增加质子解离性并因而能有效地结合。

11.蛋白质样品（抗体、Fab片段或蛋白质）与10~40倍过量摩尔数的Cy3在室温反应30min(按第8~9步所描述的进行)。将染料非常缓慢地加入到用移液管尖头搅拌的溶液中（小心操作以避免染料直接与微离心管接触)。
为了避免蛋白质因为DMF而变性，所加人的Cy3/DMF体积必须不超过总体积的10%。
最佳的过量摩尔数以及反应时间都是根据经验来确定的。标记的目标是能使毎一个蛋白质分子与1~3个染料分子结合（对于标记比例标准的讨论，请参阅本方案的导言部分)。对于不同的蛋白质或抗体，其标记水平有很大的变化。如果最终的标记率太低，可能可以重新标记抗体。像T(p)250和MC5等抗体，已经成功地用超过40倍过量摩尔数的染料进行标记。

12.加入最终浓度为10mmol/L的含有游离氨基的缓冲液，如Tris等来终止标记反应。

13.采用凝胶过滤柱系统（10DG,Bic-Rad)来交换缓冲液以除去多余的未反应染料，并将蛋由质洗脱至PBS中。
a.用三倍量填料体积的PBS或其他选定的缓冲液（约30ml)平衡柱系统。
b.为了达到最大分离，将标记反应的混合物直接加到树脂上，并注意使它的体积越小越好。
c.用2.5ml缓冲液（上空体积约为3.3ml)清洗柱并废弃洗脱液。
d.另外加入2ml缓冲液并收集可见蛋白质组分，将剩余物丢弃。标记产物将跑在前沿，并可以肉眼观察到，而游离染料从柱上洗脱较慢。

14.采用Centricon浓缩器（可以截流适当大小的分子）再次对标记蛋白质进行浓缩。

15.采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析标记产物，以便验证蛋白质是否成功地被标记。产物经电泳分离后，直接用紫外透照仪（302nm)检査凝胶上的可见标记产物。
荧光带迁移至蛋白质的预期分于质量部位。在电泳迁移的前沿没有游离染料的荧光；
对于大多数染料，在302nm的紫外激发是较好的选择。如果对凝胶照射时不能看到带，则可以考虑采用更短波长的激发光。

16.标记反应以后，采用下述公式计算标记率：

                                          A_λXM/[(A₂₈₀-ƒXA_λ)Xε_λ]

式中A_λ是染料在其最大吸收波长λ处的吸收度，A₂₈₀是蛋白质在280nm的吸收度，M是以kDa为单位的蛋白质分子质量，ε_λ是染料在波长λ处的摩尔消光系数，以L•mmol^-1•cm^-1为单位。公式以染料在280nm处的吸收进行校正。系数ƒ是染料在280nm和最大可见吸收波校λ的吸收度比值。例如，Cy3标记抗体的标记率公式就变为：

                                       A₅₅₄X170/[(A₂₈₀-0.05XA₅₅₄)X150]

为了验证染料的结合是否会影响Fab,整个抗体或者蛋白质的生理功能，将标记产物与相应的未标记成分进行持异性活性比较。特异性活性包括催化活性或蛋白质结合活性。这些蛋白质结合分析可以采用琼脂糖固定的肽配体或磷酸酪氨酸颗粒来进行。这种结合活性测试的标准探作规程可以参阅《抗体技术实验指南(UsingAntibodies)》（HarlowandLane1999)。(该书中译版已由科学出版社2002年9月出版。------编者注）

第二阶段 FLIM.FRET分析的细胞制备

材料

缓冲液和溶液
将贮存溶液稀释到适当的浓度。

明胶溶液（0.1%)
可选，请参见第1步。
将0.5g明胶（Porcine,Sigma)溶于500ml1X麻酸盐缓冲液液中。高压灭菌。

磷酸盐缓冲溶液（PBS)

聚-L-赖氨酸
可选，请参见第1步。
可以从Sigma购得0.1%(m/V)水溶液，使用前用水按1:10稀释。

核酸和寡核苷酸

载有探针的质粒DNA

编码了目标蛋白质的GFP融合载体（CLONTECH)。

培养基

CO₂-非依赖性成像培养基
这种低背景的荧光培养基可以从LifeTechnologies购得，或者采用经Dulbecco修改Esgle"s的培养基的标准组成中除去下列成分以后的培养基：pH标记物酚红、青霉素、链霉素、叶酸以及维生素B2。使用前采用以NaOH调至pH7.4的无菌HEPES(终浓度为50mmol/L)来补充培养基。
成像培养綦必须不含有自动荧光成分。

专用装置

组织培养板（6孔或12孔）（Nunc),或者

玻璃底组织培养皿（35mm,MatTekCorporation)，或者

腔室载玻片或腔室盖破片（Labtek,Nunc)。

附加试剂

本方案中的第2步需要用第16章中介绍的转染方法所需的试剂。

细胞和组织

进行转染的细胞株（贴壁或悬浮培养）
除了考虑细胞株是否适合所研究的系统以外，选择细胞类型惟一需要考虑的就是通过—些方法可以方便地将它们固定（请参见第1步说明）。

方法

1.将细胞移植到适当的表面进行显微观察：
对于活细胞制品：将细胞铺到玻璃底平皿或腔室盖玻片中。
对于转染后固定的细胞制品：将细胞移植到置于6孔或12孔组织培养皿中的玻璃盖玻片上。
容器的最终选择取决于细抱在转染后是否需要微注射；如果需要.则应根据针头操作需要来考虑器皿的形状和剩余空间。
对于悬浮细胞，固化柯以更方便地使用像明胶（0.1%,m/V,PBS;高压灭菌）或聚L-赖氨酸（0.01%水溶液，m/V)等培养基。两种情况下,均采用所选择的培养基覆盖小孔、盖片或者盖玻片约30min来对上述材料表面进行包覆，再吸出过剩的培养基，然后，将细胞直接移植到培养基裏盖的表面。在转染操作过程中，细胞也可以保持在混悬液中，到成像前再立即固化细胞一旦固化后，就可以进行微注射了。
将细胞按-定的密度涂板，使约40%的细胞在第二天可以融合。

2.采用第16章中所介绍的任意一种转染方法，用编码了GFP标记的目标蛋白的质粒转染细胞。

3.转染细胞在适当条件下孵化16~24h,以使细胞表达目标蛋白。
在有些情况下，必须梢确控制蛋白质表达水平。此时，建议在进行FLIM測定前先优化转染效率以及表达周期，可以采用调整的增强子来促进蛋白质的表达（请参见第17章)，或者采用核微注射来替代转染（请参见本方案结束处的“替代方案，活细胞的微注射”）。

4.表达了目标蛋白质的细胞的鉴别。

5.(可选）如果实验设计允许,选择第6步后面的替代方案，即微注射(用于活细胞）或者固定和染色(用于固定细胞)，中的一种方法来导入另一探针(如:标记蛋白）。

6.在进行显微实验以前，立即用CO₂非依赖性成像培养基（市售培养基或按材料项介绍的方法调整的经Dulbecco修改的Eagle’s培养基)替换培养基。
在实验设计中，如果在有关的处理前需要将细胞血清饥饿，则在成像前按所介绍的时间段让细跑饥饿。但是,如果细胞在缺乏血浆时会发生凋亡的话，就应在饥饿期间将细胞置于0.5%的胎牛血淸中，然后在成像前立即用无血淸培养基替换。






第三阶段 FLIM·FRET测量

材料

专用装置

放大器（ENI403LA或Intra-actionPA-4)

氩激光（Coherent,Innova70C)

宽带绝缘反射镜（2个；NewportCorporation)

检测器

MCP，HamamatsuC5825或LaVisionPicostatHR

CCD,配备KodakKAF1400芯片的PhotometriesQuamix

滤光器

GFP,OG(Q495LP,HQ5lO/20;Chroma)

Cy3(HQ545/30,Q565LP,HQ610/75;Chroma)

单面镀银反射镜（Zeiss)

曲镜座（2个)，透镜支架（2个)，标竿（5个），以及后支架（5个）（Newport)

倒置显微镜（Zeiss135TV)

IPLabSpectrum(SignalAnalytics)

可变光圈（Comar)

透镜（分别为焦距12和7.6cm、焦距2.5和3.8cm;Newport)

水银灯（100WZeiss;HBO100AttoArc)

Multimodefiberstep-indexed1-mmcore(步长指数1mm内核的多态纤维）

(Newport)

油接物镜（100X/1.4NA;ZeissFluar)

光学操作台（2X1m;TMC)

Powermeter和head(Ophir,NovaDisplay和2A-SH)

配备PCI-GPIB卡（NationalInstruments)的PowerPC(Macintosh)

快门（高速)VincentAssociates,UnIBLitzVS25)

快门启动器（VincentAssociates,UniblitzVS25)

驻波声-光调制器（acousto-opticmodulator,AOM)(Intra-action,80MHz)

倍频合成器（IFR2023)

可变密度滤光器滑轮（LaserComponents)

水循环冷却装置（Grant)

细胞和组织

按第二阶段所介绍的方法制备表达了蛋白质探针的细胞（活的或固定的)

方法

1.调节波长选择棱镜，选定488nm的氩激光为激发波长。采用激光背面的控制旋钮微量调整高反射镜面的位置来优化输出功率。

2.设定频率合成器来启动AOM至共振频率约为40MHz(对于这里所介绍的实验，采用的启动频率为40.112MHz)。这使得激光束以两倍于驱动频率（80.224MHz)的强度振动。

3.通过调节入射角的角度和用光度计监测非衍射零级光的强度来优化AOM的衍射以及调制强度。在优化的衍射角度（达到相应的最大衍射）时零级光的输出功率最小。

4.开启MCP和CCD。将光阴极电压的基底值设为-2V,并调整增益以匹配CCD的满动力范围。这取决于样品的荧光强度，并需要凭经验来确定。最理想的是，使增益值尽可能小以降低噪声。通常将HamamatsuC5825的增益值设定为1,而PhotometricsQuantixCCD的增益值设定为3。将CCD的示值读数设定为2X2栅格。

5.将主频率合成器驱动MCP的频率设定为驱动AOM频率的两倍（对于上面所举的例子即为80.224MHz)。

6.选择最合适的物镜来进行实验。在本例中使用的是ZeissFluar100x/1.4NA油物镜。

7.为了得到零级寿命参照图像，从强扫描开始每相隔22.5°记录整个一周16张相位依赖性图像（例如：将一小片铝箔置于盖玻片或玻璃底平皿的成像表面)。

a.将荧光滤器部件改为单面镀银反射镜，并用可变强度滤光滑轮将外来光的强度调至最小值。将聚焦点调整至铝箔表面。
注意：当设置铝箔成像时，在将外来光源的强度调至最小值以前，千万注意不要直接用肉眼看显微镜。

b.照一张曝光时间约为100ms的铝箔图像。这张图像是用来选择ROI并估计所需的最佳曝光时间的。因为此时主频率合成器的相位可能不是最大的，为了避免检測器的饱和，应该选择可以生成约1000个计数的曝光时间。

c.每相隔22.5°记录整个一周16张相图，测定图像系列中达到最大强度时的相位，并在主频率合成器上重新将该相位设为0度。

d.记录铝箔另一周十六张相图并记为零级寿命参照图像。
当进行寿命成像时，我们建议随时监测相稳定性。我们的装置一小时内相位可以稳定在0.3°以内。对于我们的装置，每小时记录并保存一组参照铝箔像序列。

8.将外来激发光源保存为最大（利用可变强度滤光滑轮）；这样系统就已经准备好可以采集细胞的图像资料。

9.用GFP滤光器设置（分光器：Q495LP,激发装置：HQ510/20)获取一张供体图像。曝光时间设定为能达到75%的CCD动态范围（对于12位CCD为3000个计数)。在图像中选择感兴趣的区域来測定荧光寿命。

10.制备供体荧光寿命图谱：

a.获取两个邻近的、一个正相另一个反相循环的16张相位依赖性图像（间隔45°相位）系列来校正相淬灭。按第9步的方法优化每一张相图的曝光时间设置。

b.在没有样品照射的情况下获取另一张图像。将这张去除背景的图像从系列的所有相图中提取出来，然后将正相和反相循环中每一对相同相位的图像进行一级加和来修正供体的淬灭。

c.由这些资料以及零级寿命参照图像（铝箔），按照本方案导言部分关于图像操作的讨论中所介绍的方法来计算供体荧光寿命图谱。

11.记录受体的图像，然后将照明光源改为100W水银灯（ZeissAttoarc)来淬灭受体。将Cy3滤光部件（激发装置：HQ545/30;分光器：Q565LP;发射装置：HQ610/75chroma)移到检测通路中。将曝光时间优化到可以占满CCD整个动态范围后，获取受体图像。在不能检测到Cy3荧光的条件下，关闭检測器部件，照射受体。
重要，当进行受体的光漂白实验时，明确光漂白以后，在供体通道内的受体的光产物没有荧光这一点是极为重要的。