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荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基因片段实验一荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基因片段
蚂蚁淘
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| 实验材料 | 核苷酸 试剂、试剂盒 | 冰水8-羟基喹啉秋水仙素固定剂酶解缓冲液 仪器、耗材 | 载玻片玻璃盖玻片解剖针及镊子
实验步骤 | 原位杂交的基本操作方法（图14.2)演化自Southern杂交：标底是玻片上的染色体和细胞核，探针是带标记的待测DNA序列[本书中即是转基因和对照，图14.3(a)]。对探针和染色体分别或同时进行变性处理，以便产生杂交分子（图14.2)。多数实验方案采取杂交过夜的方式，这对于低拷贝FISH非常重要。而对检测重复DNA序列，杂交时间有几小时就足够了。正如Southern杂交一样，需要经过数次的洗涤，目的是去除未结合的探针并鉴定杂交的紧密性，也就是鉴定探针和目的DNA序列的相似度，而这是在一个双链DNA螺旋中保持稳定杂交的必要条件。为了准备染色体，除了杂交温度、钠离子浓度和洗涤液等条件外，一种双螺旋去稳定剂如甲酰胺也可以调控杂交紧密度。在直接FISH技术中，染色体可以马上复染，常用DAPI复染；在使用荧光素和地髙辛标记的非直接性FISH中，需要使用免疫细胞化学的方法做检测。  染色体荧光染色[图14.1(a)]，按照染色体固定和制备的操作，检测转基因的株系及个体的倍性水平（见3.1节和3.2节），然后进行复染、封片和分析等步骤（见3.7节和3.8节）。 1.材料固定 制备含有大量干净而铺展的分裂中期染色体，是保证FISH和染色体染色成功的重要因素。用于固定和染色体制备的植物材料必须是健康、无病害并生长旺盛的。它可以是任何分生组织，但在转基因植株生长过程中，用什么材料做检测，则取决定于试验的时间，可以取幼苗的根尖、盆边缘老株上新长的根尖，或者水培植株的根尖。对某些物种来说，也可以选用嫩枝、叶片或新芽的分生组织细胞。 在多数情况下，获得最大数量的分裂中期的染色体对试验成功是很重要的。为了获得更多的处于分裂中期的细胞，常常需要对材料进行预处理，使染色体发生浓缩，并破坏纺锤体微管，以获得充分分散的染色体。纺锤体微管抑制剂，如秋水仙素（广泛用于染色体计数）可以形成高度浓缩的染色体，另一些染色体浓缩剂，如冰水或者8-羟基喹啉，能产生更为伸展的染色体，以更适合于FISH分析。 (1)所有步骤均使用干净的镊子在干净的容器中进行。在收集和预处理阶段（步骤2~4)，避免将材料接触固定剂和化学药品（见注11)。 (2)选择合适的植株材料以获得分裂期细胞。确认材料生长于适宜条件下。  (3) 选择细胞分裂期阻滞剂加入试管中。 (4)将根（1~2cm长）或者芽转移至3~5ml的分裂期阻滞剂中（见注12)，试剂用量是材料的5倍，然后将盖子拧紧。 (5)培育。 (a)冰水：24h (b)8-烃基喹啉：生长所需温度下放置30~45min,然后4℃、30~45min。 (c)秋水仙素：室温2~4h或者4°C、12~16h。 (6)将材料迅速吸干，放入新鲜固定剂中。为保迅速渗透，确保固定剂没有水分污染。除管子上用（油墨）毡笔做标记外，用铅笔在便签或小纸片上做好记号，然后将纸片一并放入固定剂中。 (7)室温放置1h，然后保存于4°C或者-20℃（见注13)。 3.2染色体制备 无论是荧光染色还是FISH，分裂期和分裂间期的染色体制备均于载物片上进行。 建议使用蛋白水解酶对材料进行预处理，以去除细胞壁和细胞质，再将样品置于载玻片上，滴上乙酸，然后盖上玻片压片。所有操作均于室温下进行，除非是特殊说明。在洗涤和材料准备时使用小培养皿，方法见2.2节。 (1)用酶缓冲液洗涤植物材料上的固定剂两次，每次10 min。 (2)转移植物材料到1~2ml酶解液中，依据材料的不同在37℃温育30min到2h(见注2)。 (3)将植物材料从酶解液转移至酶缓冲液。 (4)将2~3份材料移至0.5ml45%的乙酸中，放置几分钟。如果材料太软，此步骤可以省略。 (5)将载玻片浸泡到96%的乙醇中再用无毛布擦干。载玻片上滴一滴60%乙酸。 然后将一小块根尖或其他的材料放入乙酸中。可根据需要更换乙酸。 (6)在解剖镜下，撕开组织或用玻棒轻敲组织并去掉颗粒物。处于分裂期的细胞更易浮起。 (7)用手纸擦盖玻片后放到玻片上，相差显微镜观察。为获得最适片子，用手(拇指）压片，用力或轻或重，根据需要。也可敲打盖玻片（译注：建议用皮头铅笔的橡皮头敲）。 (8)显微镜下观察细胞密度和分裂中期指数，将比较好的样品放置到金属板上置于干冰中5~10min (不要过长时间）。用刺须刀刀尖轻轻挑开盖玻片，然后风干。 (9)相差显微镜下浏览未封片的玻片。寻找充分分散、不成堆聚集的细胞核，玻片应没有表层膜和杂质。分裂中期染色体应该充分分散，没有细胞质和杂质残渣等。对每张玻片进行记录以优化下次制片过程。小染色体可以通过DAPI染色来检测（见3.7节)。 (10)在玻片上划上线以标记样品所在玻片上的位置，因为在其后的步骤中，样品位置在潮湿的玻片上是看不见的。 (11)玻片于4℃干燥保存数天或者于-20℃保存数月（见注13)。 3.3探针标记 因为基于随机引物法或缺口前移原理的相关操作说明在商用试剂盒已有提供，本章不再讲述标记DNA的实验操作方案。直接PCR标记法也是常用的方法，这种方法是在扩增克隆的特定片段，或扩增总基因组DNA的特定片段时，结合引入带标记的分子。 为保证FISH的成功，必须在探针中引入比例合适的带标记分子，以便于检测。为使聚合酶作用更有效，带标记的核苷酸（dUTP或dCTP)与非标记TTP或CTP按1:2混合。试剂生产商常常提出标记核苷酸的推荐浓度和稀释度，以获得最佳整合效率。这是一个标准实验的起点要求量，不过一些非常昂贵的标记核苷酸，尤其是刚打开的还未经多次冻融的试剂，其用量可以减少至推荐用量的50%~70%。另一个重要因子是标记后探针的长度。探针不能太长，一般是200~600bp，以免不能渗透进染色体的DNA中。随机引物法和缺口前移法产生的探针长度恰好适宜于FISH，不过，有时可能需要对缺口前移酶体系中的DNA酶组分加以调整。用PCR法标记较大的插入克隆，可能不会得到好的探针。 另一个影响标记成功与否的因素是模板DNA的纯度，以及用于加标记的DNA模板序列的长度。使用克隆片段时，要确保小量制备的DNA是纯净的、未受细菌污染，这样插入片段才能被干净、完整地酶切。对较小的插入片段（100bp到2kb)，推荐使用M13测序通用引物进行PCR扩增，这样能获得非常纯净的模板DNA。在用随机引物法或切口前移法进行标记前，最好将PCR产物经电泳后割胶回收目的条带，以纯化模板DNA。对较长产物，小量提取的DNA可以在质粒线性化或酶切目的片段后直接标记。 不过，我们发现大的DNA分子常常不会是很好的模板，可能的原因是，如果聚合酶不在DNA模板分子的末端停止，酶就无效了。因此，将大DNA分子通过超声、加热或者酶切的方法处理后，再进行标记效果会更好（见[4]、[19])。 检测转基因片段时，推荐使用生物素标记法[图14.3 (a)]，因为生物素是最小的半抗原，通常最易整合，市场上也有销售专用的生物素试剂盒。其次，许多不同的亲和素、链霉亲和素或者抗生物素抗体，能与荧光染料紧密而稳定的连接，这些都可以从市场上购得（如Alexa dyes和Molecular Probes公司）。作为第二对照或者指示探针，可用地高辛或直接荧光染料标记，建议使用5SrDNA，因为它广泛存在，并且在许多物种中都有主荧光和次荧光位点[图14.3 (a)]，能提供最好的FISH实验对照。45SrDNA也可以使用，但是常常有强荧光位点出现，其荧光信号强过转基因的杂交信号。另一个非常好用的是重复DNA序列，它可以帮助鉴定染色体。 3.4玻片材料预处理 开始原位杂交前，应将玻片材料进行预处理以增强探针向目标位点的渗透，如用胃蛋白酶或蛋白水解酶处理表面蛋白，并减少非特异性探针与检测试剂的结合，如RNA酶和胃蛋白酶/蛋白水解酶处理。之后将样品用多聚甲醛和乙醇再固定，使样品经多次洗涤后仍稳定存在。 (1)所有步骤均于室温下染色缸里进行，除非其他说明。 (2)在每个玻片划标记处加入200μlRNA酶，盖上塑料盖玻片，在保湿盒中温育1h。 (3)去掉盖玻片，将载玻片在2xSSC中洗涤两次，每次5min。 (4)玻片放入10mmol/LHCl摇晃2min左右，每张玻片迅速加入200μl胃蛋白酶液，盖上塑料盖玻片，37℃温育10min (见注6)。 (5)在蒸馏水中洗脱盖玻片，然后用2XSSC洗玻片两次，每次5min。 (6)将玻片放入通风橱中盛有多聚甲醛固定剂的染色缸中放置10min。 (7)2XSSC洗玻片两次，每次5min。 (8)浓度梯度乙醇逐级脱水（70%、90%和96%各2min),风干。 3.5杂交混合变性和杂交 (1)离心管中准备杂交液，见表14.1，充分混合。  (2)在离心管中加入34μl杂交液、2 μl转基因探针、1μl指示探针或对照探针，蒸馏水补齐至40μl，作为探针混合液。 (3)探针变性，放入70°C水浴锅10min,然后置冰上5min。 (4)将探针混合液滴到玻片上染色体所在位置，用塑料盖玻片盖好，注意去除所有气泡，如有气泡，需要揭开盖玻片重新盖上。 (5)将玻片放到加热块上，升温至变性所需温度，一般是75°C、8min。根据不同物种、不同制备方法和材料储存时间的不同，变性温度在70~95℃之间，时长6~12min(见注14)。 (6)降温至37℃放置10~20min,将温度保持在37℃准备杂交。 (7)如果加热板可以保湿，可将玻片保留在加热板上，如果不行，将玻片转移到烘箱的保湿盒或者水浴锅中用于杂交。注意不要让样品干掉，也不要让冷凝水积累到样品上。过夜（16h)。 3.6严谨性洗涤和杂交位点检测 (1)配制洗涤液和检测缓冲液，见2.6节。 (2)从杂交中取出玻片，检查样品是否蒸干或者被冷凝水打湿。 (3)在42℃、2XSSC中将盖玻片浮去，注意玻片间不要刮擦。 (4)玻片于42℃、2XSSC中洗涤2min。 (5)玻片于42℃严谨性洗涤液中温育两次，每次5min,准确测定并记录洗涤液的温度。使用0.1%xSSC高严谨度洗涤或者2XSSC低严谨度洗涤（见注8)。 (6)玻片于42°C的2xSSC中洗涤三次。 (7)从水浴锅中拿出玻片，自然冷却10~15min。 (8)玻片转移至检测缓冲液放置至少5min。 (9)在每个玻片的记号处加入200μl的BSA,盖上塑料盖玻片放置5~30min。 (10)根据探针标记准备检测液（见2.6节），去掉BSA,吸取50μl检测液到玻片上，盖上塑料盖玻片，37℃保温箱温育60min (见注9)。 (11)去掉盖玻片，检测缓冲液洗涤三次，每次5min。 3.7复染及封片 大多数样品需要进行DNA复染来观察染色体。复染染料颜色必须与探针颜色不同，其信号也不能太亮使杂交信号模糊。因此，建议先染色再封片。一些实验操作将复染和封片合并为一步，这样做省了一个步骤，但是可能导致染色过度和背景值偏高。第一个荧光FISH实验使用碘化丙啶染色，当用蓝光或者绿光作为激发光时，染色体呈红色。 双靶标FISH实验中，当用红色和绿色标记荧光探针时，使用DAPI在紫外激发下呈蓝光比较合适（图14.3)，因为它常常能同时显示出异染色质带型。在制备染色体过程中，DAPI也是一种检测染色体的质量和数目的很好染料，当染色体很小时它特别有用[图14.1 (a)]。 (1)向载玻片上滴入50~100μI的染色液，用塑料盖玻片盖好，然后于室温、黑暗下放置10min (见注5)。 (2)移除盖玻片，用检测缓冲液短暂洗涤（见4.2.6节）。 (3)吸干缓冲液，向盖玻片上滴入一滴抗荧光淬灭封片液，然后盖上玻璃盖玻片。配合滤纸片用手挤压玻片以去除多余封片液（见注15)。 (4)玻片观察。淬灭剂可能需要几个小时才能渗透至样品中，因此可放置过夜后再进行观察和拍照。 3.8观察和拍照 使用落射荧光显微镜观察探针杂交点和染色体染色。本章不是对显微镜的使用进行说明，只是对一些常见问题和解决办法提出如下建议。 (1)即使使用很好的荧光抗衰剂封片，荧光染料和原位杂交信号也可能非常微弱并会迅速衰减，因此显微镜应置于一个全黑暗房间的固定台面上，并且摆放要便于操作。确保系统合理放置，调整光源居中。 (2)确保仪器和浸油以及UV为荧光专用。浸油应室温黑暗放置。运输车内阳光的热量、混合油、浸油吸水等都会促使浸油自发荧光或者不透UV。 (3)—般情况下，最好使用针对单一荧光的特定滤波片。多通道滤波片也可以买到，但由于不同荧光的光强不一样导致这种玻片不太好用，并且不同荧光间的杂交激发常使结果很难分析。确保滤波片没有随着使用时间的增加而发生特性改变。 (4)使用胶片或者数码相机拍照。两者都能获得满足发表标准的图像分辨率。但是，必须注意的是，不管多贵的数码系统都无法补偿显微镜直接观察的优势。当使用胶片时，彩印胶片比幻灯片更好，因为它有更好的曝光范围，并且价格和打印都更便宜。 (5)玻片应一直放在抗衰减剂中，这样能极大地阻止荧光信号的衰减。 (6)记录荧光信号前要特别小心，不要让染色体信号尤其是微弱的FISH杂交信号衰减。低倍镜下观察一般不会衰减信号。但到63x和100x时衰减很迅速。有必要先安装好照相系统，焦平面一旦聚焦就可迅速按下曝光键。先将FISH信号拍照记录好，在找到满意的FISH杂交信号前，不要用DAPI观察染色体荧光。 (7)当观察一个肉眼几乎看不见的弱荧光信号时，聚焦图像会很困难。可以在红光和绿光焦平面之间轮换着观察。DAPI不便这样操作。 (8)不论使用数码相机还是普通胶片，使用图像处理软件（如AdobePhotoshop、Corel Draw或者其他类似软件包）分析，叠加和组合各种图片是最方便的。但是，必须注意图片不可过度处理。责任人必须清楚地意识到对实验室成员的图像处理是要负责任的！ 3.9转基因的FISH分析 实验中最困难的部分可能是判断所观察或记录的信号是否真实可信，尤其是低拷贝转基因的信号。 (1)检查有丝分裂中期是否完整，染色体形态是否保存完好。染色体可以稍显臃肿，但不能太发散。染色体应该没有破损，没有洞隙或扭曲。 (2)确保对照探针有预期结果。 (3)注意观察背景信号和非特异性交叉杂交信号，它们可能模糊掉真正的FISH信号[图I4.3 (b)和图14.3 (c)]。任何焦平面外产生清晰边缘的信号都可以去除[见图14.3 (a)]。星点状强信号[图14.3 (d)]常常意味着探针或检测剂已经变质。 (4)统计染色体上的转基因FISH信号。分析若干有丝分裂中期细胞，可能的话，鉴定出染色体和FISH信号的位置。在一个正常的二倍体细胞中，一个二倍体位点应该在同源基因所在的两条染色质的相同位点上产生荧光信号（见注16)。当目的条带小于50kb时，由于染色体的螺旋和挤压，不太可能在同一个分裂中期细胞中观察到所有位点的信号，所以在任意某个分裂中期细胞中，不要指望看到所有的信号点。不过观察5~10个或更多分裂中期细胞后，应该能确定哪个是真实信号，哪个是背景信号。当观察到荧光强度高和可靠性好的信号时，表明几个转基因以串联的方式整合到基因组中了[[18]、[19],见图14.3 (a)]。 (5)最重要的一点是要比较同一个探针或者同一批实验所得到的玻片，以此排除实验失败、实验污染或探针标记无效、抗体稀释度不合适或者其他试剂使用不当等因素。
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