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鉴定分析植物蛋白复合物的蓝绿非变性凝胶电泳实验一鉴定分析植物蛋白复合物的蓝绿非变性凝胶电泳
试剂、试剂盒 | 十二烷基β-D-麦芽糖苷增溶液TritonX-100增溶液洋地黄阜苷增溶液考马斯亮蓝染色液丙烯酰胺溶液BN凝胶缓冲液
实验步骤 | 3.1BN-PAGE样品的制备 所有样品制备步骤必须在4°C下操作,在开始制备样品前(见26.3.1节1和26.3.1节2),要制备好BN凝胶(见26.3.2)。 1.膜组分 (1)按照标准的方法步骤制备要研究的膜组分,如细胞质膜、类囊体膜或线粒体膜。或者使用完整细胞器,如质体、线粒体或过氧化物酶体,作为BN-PAGE的初始实验材料。 (2)确定蛋白质浓度,如用Lowry方法等。 (3)将蛋白质浓度调为10μg/μl。 (4)15000g离心100μl样品10min,沉淀膜或细胞器组分。 (5)用十二烷基β-D-麦芽糖苷,TritonX-100或洋地黄皂苷增溶液悬浮沉淀物(见注释1)。 (6)将悬浮液置于冰上15min。 (7)20000g离心20min,去除不容物。 (8)加入5μL考马斯亮蓝染色液。 (9)直接加样50~100μl的上清液(相当于0.5~1.0mg蛋白质)到BN胶上(蛋白质的定量为可被考马斯亮蓝染色,如用银染,蛋白质量可减少到1/10)。 2.水溶解组分 (1)按照标准方法制备要研究的水溶性蛋白质,所用的缓冲液不能含高盐浓度或者离子去垢剂。蛋白质浓度要调节到10μg/μl。 (2)在100μl样品中加入2μl考马斯亮蓝染色液。 (3)20000g离心20min,去除不溶物。 (4)直接加样50~100μl的上清液(相当于0.5~1.0mg蛋白质)到BN胶上(如用银染,减少蛋白样品的加样量,见26.3.1节1中第(a)步骤)。 3.2BN-PAGE 如果电泳分离距离大于12cm,BN凝胶就可以获得最好的分辨能力。下面所介绍的方法是在Bio-Rad公司的ProteinII电泳仪(Bio-Rad,Richmond,CA;凝胶尺寸:0.15cmX16cmX20cm)上做的实验,其他公司生产的电泳仪,如HoeferSE-400或SE-600电泳仪(GE Healthcare, Munich, Germany),也同样适用于 BN-PAGE电泳。由于蛋白复合物的分子质量可从50kDa到几千kDa,所以有时要用到梯度凝胶来分离(见注释2)。 (1)将1.8ml丙烯酰胺溶液,3.3mlBN凝胶缓冲液,14.9ml双蒸水混合在一起,配制成4.5%分离胶溶液。 (2)将6.7ml丙烯酰胺溶液,3.3mlBN凝胶缓冲液,6.0ml双蒸水,4ml甘油混合在一起,配制成16%分离胶溶液。 (3)将这两种溶液分别灌入梯度生成器中,在这个梯度生成器上连接软管和针头,并与做胶的两块玻璃板之间的空间连接,这样就可以从顶部灌胶(16%分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间),或从底部灌胶(4.5%分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间)。 (4)在这两种凝胶溶液中加入TEMED和APS (90μl10%APS/9μlTEMED加入到4.5%分离胶溶液中;65μlAPS/6.5μlTEMED到16%分离胶溶液中)。 (5)灌梯度胶,在顶部为浓缩胶留一定的空间,用双蒸水封胶液,凝胶将在60min内聚合。 (6)倒掉双蒸水。 (7)将1.2ml丙烯酰胺溶液,2.5mlBN凝胶缓冲液,11.3ml双蒸水混合在一起,配制成浓缩胶溶液。 (8)在浓缩胶溶液中加入65μlAPS和6.5μlTEMED,将其倒入插梳周围的空间,浓缩胶将在30min内聚合。 (9)稀释相应的电泳缓冲液的浓缩储液,分别制备成1X的阳极和阴极电泳缓冲液。 (10)当浓缩胶聚合后,小心移走插梳。 (11)将阳极和阴极电泳缓冲液分别加到电泳仪的上、下槽内,冷却电泳仪到4°C。 (12)将经考马斯亮蓝预处理的蛋白样品加样到凝胶凹槽里。 (13)将电泳仪与稳压电源连接,一开始时,100V恒定电压电泳45min,接着以15A恒定电流电泳8h。要在4°C电泳,电泳过程中可看到BN胶上的条带。 3.3第二相的SDS-PAGE 1DBN-PAGE分离的蛋白复合物可用考马斯亮蓝染色或银染,用胶内酶学检测了解其活性,或转移到印迹膜进行进一步的分析(见注释3和注释4)。用第二相有SDS存在的凝胶电泳能分离出蛋白复合物的亚基组分,所有已发表的SDS-PAGE实验方法都可与BN-PAGE结合,如Laemmli发表的电泳系统[24]。但是一般来说,Schagger和vonJagow[25]开发的Tricine-SDS-PAGE系统的分辨率最高。下面所介绍的方法是在Bio-Rad公司的ProteinII电泳仪(Bio-Rad,Richmond,CA;凝胶尺寸:0.15cmX16cmX20cm)上做的实验,其他公司生产的电泳仪也同样适用。 (1)剪下一条BN胶,室温下将其浸泡在变性处理溶液中30min。 (2)用双蒸水冲洗胶条30~60s(这一步骤很重要,因为β-巯基乙醇抑制丙烯酰胺的聚合)。 (3)将胶条放在电泳仪的玻璃板上的正常胶梳的梳齿位置上。 (4)再用1mm橡皮密封条、第二块玻璃板和夹子等,组装凝胶电泳仪。将所有需要的东西倒入灌胶器中(与第一向的胶条厚度(1.5mm)相比,减少第二向凝胶的厚度到1.0mm,以避免第二向胶条沿着垂直方向滑落下去)。 (5)将10ml的丙烯酰胺溶液、10ml的SDS凝胶缓冲液、10ml双蒸水、100μl的APS和10μl的TEMED混合在一起,配制成16%分离胶溶液,将其倒入电泳仪两块玻璃板之间的BN胶条以下的空间,为嵌入BN胶条的样品胶溶液留下空间。用封胶溶液封胶面,大约60min内凝胶聚合。 (6)将4.1ml的丙烯酰胺溶液、6.7ml的BN凝胶缓冲液、2ml甘油、200μl的SDS溶液、6.8ml双蒸水、160μl的APS和16μl的TEMED混合在一起,配制成10%样品胶溶液。 (7)倒掉封胶溶液,倒入样品胶将BN胶条嵌入,倾斜凝胶架子,使BN胶条下面的空气释放出来。 (8)分别在电泳仪的上、下槽加入SDS阳极和阴极电泳缓冲液。 (9)将电泳仪接上稳压电源,30mA电流下,电泳过夜。 作为一个替代系统,第二向电泳可在天然条件下进行(见注释7)。 3.4染色 用所有的标准蛋白质染色方法可以显色2DBN凝胶上分离的蛋白质,如考马斯亮蓝染色、银染、荧光染料染色等。如果接着用质谱仪鉴定蛋白质,建议使用考马斯亮蓝染色,下面介绍由Nenhoff等开发的基于胶态考马斯亮蓝染色的实验指导。 (1)将凝胶在固定液中固定处理1h。 (2)混合80ml新鲜配制的染色液和20ml乙醇溶液。 (3)将凝胶浸泡在上述溶液中过夜。 (4)用双蒸水冲洗凝胶,脱色,要中途换水直至背景清晰(如果背景颜色无法用水脱除,可使用20%的乙醇溶液脱色)。
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