材料

溶液和缓冲液

贮存液、缓冲液和试剂的配方请参照附录1。
将贮存液稀释到适当的浓度。

ddNTP延伸/终止混合物

ddNTP溶液：四种ddNTPs,各5.0mmol/L
dNTP溶液：四种dNTPs,各1.0mmol/L
EDTA(0.05mol/L,pH8.0)
甲酰胺上样缓冲液
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)

酶及其缓冲液

AmpliTaqCS或其他无外切酶活性的DNA聚合酶（5units/ul)。

5X循环测序缓冲液
200mmol/LTris-Cl(pH8.8)
25mmol/LMgCl₂

热稳定的DNA聚合酶
选择酶时，请参照本章介绍中及方法5中表12-19的介绍选择测序系统。该方法依据AmpliTaqCS写出.但其他类似的热稳定酶同样可用。

核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物，5"端由33P或32P放射性标记
请见第10章，方案2。

模板DNA
质粒、黏粒、λ噬菌体和噬菌体M13DNA以及通过第1~4章中任何方法得到的DNA都可以用作模板。表12-12表明了每种摸板的需要量（同时参考表12-4)。

特殊装置

小离心管（0.5ml)或者微孔扳（柔软，热稳定，96个300ul溶剂U型孔）
这些板可被标记以不同彩色和/或标上C、T、A和G字样。
设计好的热循环程序（见步骤5)。

方法

1.将每一种ddNTP混合物（参考表12-11)各4ul放入相应的0.5ml离心管或微孔板中。置于冰上。



2.在每管/孔中加人：

双链DNA模板                                          10~100fm
1.5pmoles5"端由32P放射性标记的引物          1.0ul
5X循环测序缓冲液                                  2.0ul
加水                                                     至5.0ul

*如果使用³³P末端标记的引物：使用5pm标准制备的由³³P放射性标记的寡核苷酸(参见附录方法：使用PCR和[a-³²P]dNTP内部标记进行的循环测序反应为保证测序混合物的化学计量。可在不增加反应体积的情况下将DNA量增加3倍（30—300fm）。

3.在1X循环测序缓冲液中将AmpliTaqCS聚合酶溶解至0.5~1.0U/ul。将1ul溶解好的酶溶液加入孔或管中。

4.轻弹管壁或摇动微孔板使物质混合。如果需要，在反应上加一滴矿物油，盖上管盖，2000r/m离心2s。确认矿物油未被紫外线照射过.否则会产生PCR的强抑制剂。

5.将管或微孔板放入PCR仪，预热到95°C。依据以下程序操作。
重要：开始程序时切勿拖延。保证在95°C预热时间不趙过3min。否则DNA聚合酶会失活。



6.取出板或管，分别加入5ul甲酰胺加样缓冲液。

7.反应物可在-20°C保存5天或直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（方案8,9,10,11和12）。变性后（100°C2min),在冰上骤冷，每种反应物用3ul上样。