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求助各位大神
RT,找公司做的稳转Hela和HepG2细胞株拿回来以后培养总是出问题。细胞寄到后显微镜下观察,状态良好。长满传代后,一瓶出现大量漂浮不贴壁的情况,一瓶贴壁后生长出现成团,生长缓慢的情况(传代后有显微观察,分散良好没有成团),一瓶传至第三代后,14h后显微观察,大量漂浮贴壁情况差。
培养基为DMEM,10%FBS,5%CO2,是随细胞寄过来的培养基。
求各位大神帮忙分析下原因,是我毕业课题,突然出现这样的问题,不想研三再换课题了。
万分感谢!
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回复:时间:2017-06-13
Ucell这两个细胞总的来说是很好培养的,考虑到试剂也是细胞来源处提供的,收到细胞状态也没问题,那问题基本就是操作不过关了,这个只能靠多练习多思考。同时也在养着好几株细胞,有hela和hepg2,没有做稳转的,养着都没有问题,状态很好。在培养稳转的这几株细胞的时候,比平时操作还要注意,但是还是出现问题了。我想问下,除了操作问题之外,还可能有哪些问题呢?
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回复:时间:2017-06-16
展开引用大悦nju同时也在养着好几株细胞,有hela和hepg2,没有做稳转的,养着都没有问题,状态很好。在培养稳转的这几株细胞的时候,比平时操作还要注意,但是还是出现问题了。我想问下,除了操作问题之外,还可能有哪些问题呢?......如果同时培养的野生型细胞没有问题,那可能是稳转株干扰或者过表达的基因对细胞生长有一定影响,这种情况建议你联系你委托构建的单位,问问他们培养过程中有没什么特别要注意的地方。
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回复:时间:2017-06-11
Ucell如果同时培养的野生型细胞没有问题,那可能是稳转株干扰或者过表达的基因对细胞生长有一定影响,这种情况建议你联系你委托构建的单位,问问他们培养过程中有没什么特别要注意的地方。好的。谢谢大神。我一直怀疑是两处培养条件有差别,导致细胞培养出现问题,委托单位说他们那边细胞培养状态很好,但是一到我们这边培养就出现问题。另外就是昨晚我37℃细胞消化3min后少部分脱壁,大部分仍贴壁,延长消化时间1min后,又室温放置消化1min左右,基本脱壁后加入培养基终止消化的,我想问下,有可能是消化这步影响的么?我们这边同时培养的野生型细胞消化时间在2-3min,委托单位那边说构建的稳转株他们的消化时间是2-3min。谢谢大神指教!
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回复:时间:2017-06-15
展开引用大悦nju好的。谢谢大神。我一直怀疑是两处培养条件有差别,导致细胞培养出现问题,委托单位说他们那边细胞培养状态很好,但是一到我们这边培养就出现问题。另外就是昨晚我37℃细胞消化3min后少部分脱壁,大部分仍贴壁,延长消化时间1min后,又室温放置消化1min左右,基本脱壁后加入培养基终止消化的,我想问下,有可能是消化这步影响的么?我们这边同时培养的野生型细胞消化时间在2-3min,委托单位那边说构建的稳转株他们的消化时间是2-3min。谢谢大神指教!......消化时间不宜过长,过长会影响生长状态
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回复:时间:2017-06-13
展开引用大悦nju好的。谢谢大神。我一直怀疑是两处培养条件有差别,导致细胞培养出现问题,委托单位说他们那边细胞培养状态很好,但是一到我们这边培养就出现问题。另外就是昨晚我37℃细胞消化3min后少部分脱壁,大部分仍贴壁,延长消化时间1min后,又室温放置消化1min左右,基本脱壁后加入培养基终止消化的,我想问下,有可能是消化这步影响的么?我们这边同时培养的野生型细胞消化时间在2-3min,委托单位那边说构建的稳转株他们的消化时间是2-3min。谢谢大神指教!......这两株细胞的野生型我这边养的时候消化时间也在2min左右,你的稳转株消化近5min不太正常,如果委托单位也是2-3min,那消化这步肯定哪有问题,贴壁细胞的消化对细胞状态影响是很大的。
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回复:时间:2017-06-16
Ucell这两株细胞的野生型我这边养的时候消化时间也在2min左右,你的稳转株消化近5min不太正常,如果委托单位也是2-3min,那消化这步肯定哪有问题,贴壁细胞的消化对细胞状态影响是很大的。好的,谢谢大神!
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回复:时间:2017-06-11
稳转株本来就是筛选出的单克隆,状态与野生型细胞比状态是脆弱一些。刚拿回来的时候尽量不要去消化,培养瓶里原带的培养基可以收集起来,每次换液先用原来带的培养基。细胞在培养箱里适应2-3天。随后传代消化时候尽量不要时间过长,不要等细胞浮起来时候再终止消化。还有终止消化的时候吹打细胞不要过于用力,轻轻吹打即可。终止的血清和胰酶一定要离心,离心!将胰酶去掉,不然很影响细胞状态。供参考
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