转染克隆的

G418

筛选和分离

对于需要建立某些基因已经整合到染色体

DNA

（通过稳定或永久转染）

的细胞系来说，

理想的是使用选择标记，通常也是必要的。虽然有许多标记可利用，但

G418(

氨基糖苷类抗

生素

)

为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。

G418

是一种氨基糖苷类似物，在结构上

与新霉素、

庆大霉素和卡那霉素相似，

它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的

合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌

APH

（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生

G418

的

解毒作用。

这一程序提供了建立

G418

选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。

1.

建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）

；

2.

细胞铺板

：转染后

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小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控

制细胞密度，

不能使细胞太密集，

应该少于生长表面的

50%

，

参考为

20%-30%

）

至

15cm

培养皿，加入

15~20ml

培养基（

DMEM

，含血清）进行培养；

3.

用最佳筛选浓度的

G418

对细胞进行筛选

：铺板完成后，再过

24

小时，抗性表达，用最

佳筛选浓度的

G418

进行筛选（对于

Hela

细胞，一般筛选终浓度为

800ug/ml

）

。具体操

作是去除旧的培养基，用

PBS

洗一次，将含有浓度为

800ug/ml

（以

Hela

为例）的培养

基

15~20ml

加入培养皿内即可；

4.

换液

：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度

（

800ug/ml

）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死

亡大部分（至少

30%

以上）

；

5.

撤药维持阶段

：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用

培养基含

G418

的终浓度为

200ug/ml

（维持浓度）

，维持生长（若细胞仍有死亡，需要

继续降低药的浓度，参考为

50-100ug/ml

）

，直至筛选克隆可见为止（大约

2~3

天）

；

6.

分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性）

，减少单个克隆受其他细胞污染

的机会。具体操作是

：

a.

用

PBS

洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。从培养皿中

除去液体，

准备

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孔板收集克隆；

b.

从培养皿中用牙签或者棉棒

（经过高压）

挑取已分

离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）

；

c.

在

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孔板的一个孔

中（事先已加入完全培养基，不含

G418

）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取

下一个克隆；

7.

CO2

孵箱，温育细胞约两小时

；

8.

两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着

。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含

50ug/mlG418

）

更换

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孔板培养基，

除去残留的胰蛋白酶，

继续培养直到培养物长满；

9.

一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是

6

孔板）

，用

50ug/ml

的新鲜完全

培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可

。