稳定细胞株筛选实验

本实验使用过表达

humanOct-4-EGFP

的慢病毒感染

HeLa

细胞。该病毒的表达框为

pLenti-CMV-Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro

：

CMV

启动子驱动

Oct-4-EGFP

基因的表达，

同

时由

PGK

启动子驱动

puromycin

抗性基因的表达。在感染

HeLa

细胞

72h

后，通过加入并维

持

2

μ

g/

μ

L

的

puromycin

杀死未被有效感染的细胞。从而在

puromycin

药物的维持下最终

获得

Oct-4-EGFP

稳定表达的混合稳定株。

关键词：

Oct-4-EGFP

，稳定细胞株，

HeLa

，慢病毒

一、实验原理

外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。

前者外源

DNA/RNA

不整合到宿主染色体中，

虽然可以达到高水平的表达，

但通常只持续几天。

后者外源

DNA

整合到宿主细胞染色体上，

使宿主细胞可长期表达目的基因。

建立稳定细胞株，

一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。

最常用的

抗性标记基因有潮霉素（

hygromycin

）、新霉素（

neomycin

）和嘌呤霉素（

puromycin

），

常用

HygromycinB

、

G418

和

puromycin

进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过

外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，

最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株，

该方法阳性率低，周期长，工作量大。慢病毒是一种

RNA

病毒，携带的外源基因在病毒感染

细胞后需要逆转录为

DNA

，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。

利用慢病毒必须整合

到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，

可以在短时间内获得高效

率的稳定细胞株。

筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，

用于蛋白的扩增和富集；

或者

得到稳定沉默特定基因的细胞株。

[

晶莱生物

]

二、实验目的

通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达

Oct-4-EGFP

的

HeLa

稳定细胞株。

三、实验步骤

实验共分以下

3

个主要步骤：

1.

细胞铺板

将

HeLa

细胞按

30%

的融合度接种到

24

孔板：

1)HeLa

细胞配成

1×105cells/mL

细胞悬液，待铺板。

2)

每孔铺

500

μ

L

，即

5×104cells/well，铺

1

块

24

孔板。

2.

感染慢病毒

12~20h

后感染慢病毒：

1)

根据公式计算病毒用量：

（细胞数×MOI

值

/

病毒原液滴度）×103=病毒用量（

μ

L

）。

2)

本实验中

MOI

取

10

，吸去与加入病毒体积相同培养基。

3)

每孔加

2.5

μ

L

的

polybrene(1mg/mL)

，使

polybrene

终浓度达到

5

μ

g/mL

。

4)24h

后换，弃去培养基后每孔加入

500

μ

L

新鲜的培养基。

3.

稳定株筛选

1)72h

以后，

加入终浓度

2

μ

g/

μ

L

puromycin

。

每隔

2-3

天换一次终浓度

2

μ

g/

μ

L

puromycin

新鲜培养基。

2)

药物筛选约

10

天后，拍荧光照片。