稳定的rAAV制造细胞的构建技术

材料

试剂

AAV质粒

pAAV:在质粒的骨架中克隆了rAAV载体的重组质粒

pRC:含有在其原始操纵子下表达的AAV和cap基因但不带病毒反向终端重复序列的质粒

这些质粒的性质将随造出的AAV的血清型和所使用rAAV载体而不同。
细胞培养基

DMEM(Sigma-Aldrich)培养基，含有10%胎牛血清（研究级别）、1%青霉素（5〇U/ml)和链霉素（Cambrex，50um/ml)

G418储存液（100mg/ml，m/V)

将5gG418(Invitrogen)溶解于50ml无菌蒸馏水中，然后将储存液用0.2Mm滤器过滤并存储在一20°C。

HeLa(ATCCCCL-2)或A549(ATCCCCL-185)细胞

潮霉素B储存液（lOmg/ml,m/V)

将Ig潮霉素B(Invitrogen)溶解于IOOml无菌蒸镏水中，然后将储存液用〇.2um滤器过滤并存储在一2〇°C。

选择性质粒

pPGK-neo:该质粒在鼠磷酸甘油酸盐激酶-1启动子控制下编码新霉素抗性
基因

pSV-hygro:该质粒在病毒SV40启动子控制下编码潮霉素抗性基因

任何可表达选择性标记的重组质粒都可以替代这两个质粒。

IX胰蛋白酶/EDTA溶液

将10X胰蛋白酶/EDTA储存液（Sigma-Aldrich)用无菌0.9%NaCl稀释，将溶液存储在-20℃。

野生型腺病毒5(Ad5)(ATCCVR-5)

方法

稳定的包装细胞系的构建

1.在转染前24h，将HeLa或A549细胞接种于IOcm组织培养盘中，密度为3XIO⁶个。

每种细胞系的密度不同，必须保证转染前细胞汇合度能达到50%〜80%。

2.用CaPO4将10ugpRC和I.0ugpPGK-neo共转染细胞。

3.24h后，胰蛋白酶消化细胞，梯度稀释悬浮细胞（1/5、1/10、1/20、1/40)，然后将每个稀释度的细胞重新接种IOcm细胞盘（两个拷贝）。培养细胞20〜24h。

4.吸去细胞培养基并且加人新鲜的含lmg/mlG418的培养基。

5.继续培养细胞3〜4周，每2d更换一次含lmg/mlG418的培养基。

在转染后7〜14d内大量的细胞死亡，转染后3〜4周单克隆开始出现，在此期间内，保持对细胞的G418选择压力是很重要的。

6•从底部观察和标记单个的克隆，然后分离单克隆。胰蛋白酶消化克隆后，使用克隆环或移液器吸头从培养板上刮去单克隆。

7•将单克隆细胞在无G418培养基中培养扩增该克隆，使之铺满两个IOcm细胞板。

8•收集一个IOcm培养板上的细胞并一80°C冻存（每瓶约5X106个细胞），用另外一个培养板上的细胞制备基因组DNA。

筛选存在和（或）capDNA的克隆

9•在病毒感染24h前，融化并扩增PCR阳性克隆，然后将细胞接种到6孔细胞板上的两个孔内（每孔约5X10⁵个细胞)。

使用合适的引物以基因组DNA为模板扩增r印和（或）DNA来筛选克隆，同时以PRC质粒为阳性对照。

10.对于HeLa和A549细胞，以感染复数为50的情况下用野生型Ad5感染其中的一孔细胞。

调整感染复数使被感染细胞达到90%,在被感染细胞孔内能清晰的观察到细胞病变。