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银染核仁形成区的标本制备及观察实验一基本方案
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| 实验方法原理 | 生化和免疫化学研究证明银染蛋白是RNA聚合酶I，其功能是催化rDNA转录rRNA形成核仁，因此通过这种反应能够特异显示rRNA转录的活性。 |
|---|---|
| 实验材料 | HL-60细胞HeLa细胞 |
| 试剂、试剂盒 | Carnoy固定液HCl甲酸AgNO3蛋白胶硫代硫酸钠戊二醛乙醇丙酮醋酸铀柠檬酸铅染液 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、中期染色体核仁形成区的银染和观察 1. 取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本，直接放入装有5NHCl溶液中，常温处理5分钟。 2. 用自来水反复冲洗几次，甩干，标本面朝上平放在平皿中。 3. 将0.1%甲酸临用前配制的50%AgNO，溶液约0.5ml，用吸管滴在标本上，再盖上二片擦镜纸。 4. 放置平皿于56℃水浴中处理3~5分钟，待擦镜纸呈棕色后，取出标本用水冲洗、气干。 5. 镜检 （1）镜下所见标本背景浅黄色，核型深染，端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑色颗粒，选择染色体分散良好，银染颗粒清楚的分裂相，进行计数单侧或双侧有银染颗粒的染色体数。 （2）人体细胞银染颗粒有遗传稳定性，一般正常值为4~8个/核型。 （3）计算方法：NOR 均值=N个核型中含NOR染色体数的和/N个核型 二、间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察 1. 收集培养的HL-60细胞和用PHA转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中，用1000rpm离心5分钟后弃上清。 2. 用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮，然后用Carnoy固定液固定30分钟。 3. 以1000rpm离心5分钟，弃上清剩约0.5~0.1ml液体，使细胞悬浮后滴片。 4. 37℃干燥24小时 5. 银染 6. 镜检 （1）镜下所见，细胞核着色而细胞质不着色，核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。 （2）肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。 三、间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察 1. 收集培养的HL-60细胞或HeLa细胞于离心管中，随后加入2.5%戊二醛1ml预固定10分钟。 2. 以1000rpm离心10分钟，弃上清后加入Carnoy固定液固定5分钟。 3. 接着以2500rpm离心10分钟，弃净上清并用吸水纸吸干残余液体，用耳勺取出细胞团块放于小平皿中。 4. 100%乙醇→双蒸水梯度复水，每步5分钟。 5. 然后将细胞团切成约1mm3大小的块。 6. 将50%AgNO3（用蒸馏水配制）-2%蛋白胶（用1%甲酸配制）2：1混合液2~3ml，加入有细胞团块的小平皿中。 7. 移置平皿于56℃水浴中处理20分钟。 8. 彻底水洗3次，每次2~3分钟。 9. 水洗后5%硫代硫酸钠室温处理10分钟。 10. 再水洗3次，转入乙醇一丙酮梯度脱水，每步5分钟。 11. Epon812包埋。 12. 超簿切片直接地或再经醋酸铀和柠檬酸铅复染后，在电镜下观察。 |
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