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低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收（用琼脂糖酶消化）
蚂蚁淘
/发布时间:1533505692 /浏览量:15
| 实验方法原理 | 可用琼脂糖酶消化的方法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA(Bumeisterandlehrach1989)。在这种方法中，琼脂糖酶使琼脂糖多聚体水解为双糖。这样获得的DNA再经酚抽提、乙醇沉淀进行纯化。由于该法较为温和，因此特别适用从脉冲场琼脂糖凝胶中回收高分子质量的DNA，从恒强电场琼脂糖凝胶中回收小分子DNA也同样有效。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 琼脂糖酶DNA样品 试剂、试剂盒 | 乙醇溴化乙锭或SYBRGold染色液凝胶平衡缓冲液BisTris-ClEDTANaCl平衡酚TE 仪器、耗材 | 煮沸过的透析袋微透析装置紫外灯水浴
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和瑢液 乙醇 溴化乙锭或SYBRGold染色液 凝胶平衡缓冲液（10mmol/LBisTris-Cl(pH6.5)，5mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1mol/LNaCl） NaCl(5mol/L) 平衡酚（pH8.0) TE(pH8.0) 2.酶及缓冲液 琼脂糖酶 3.核酸和寡核苷酸 DNA样品 4.专用设备 煮沸过的透析袋 微透析装置（LifeTechnologies） 手提式长波（302nm)紫外灯 预置温度40℃和65℃的水浴 二、方法 1.制备低熔点琼脂糖凝胶，上样并电泳。 2.从琼脂糖凝胶上切下含目的DNA的条带，转移至微量离心管内，加入20倍体积的凝胶平衡缓冲液，室温静置30min。 3.拍摄切除目的DNA条带的凝胶，以记录被切下的DNA条带。 4.将凝胶切片转移至另一约含等体积凝胶平衡缓冲液的新微量离心管中。 5.65℃温育10min,使凝胶切片熔化。冷却至40℃，加入无DNA酶的琼脂糖酶，每200μl凝胶加入1~2单位。40℃温育1h。 在此期间，琼脂糖被切为寡糖或双糖。如需要，此时的DNA溶液可直接用来进行连接、酶切以及转化等实验。 6.DNA的纯化和浓缩 (1)纯化小片段DNA(<20kb） ①用平衡酚抽取DNA溶液两次。 ②第二次酚抽取完毕，将水相转移至另一新管中，加入2倍体积的TE(pH8.0)。 ③加入0.05倍体积5mol/L的NaCl，随后加入2倍体积的乙醇（这里的体积指步骤6②中的DNA终体积）。置0℃预冷15min,微量离心机4℃以最大转速离心15min收集沉淀。 ④小心地吸出乙醇，加入0.5ml处于室温的70%乙醇。混合均匀，按步骤③所述离心。 ⑤吸去上清，打开离心管。置于操作台上数分钟，挥发去除残留乙醇。将DNA溶于适当体积的TE(pH8.0)中。 (2)纯化大片段DNA(>20kb) ①将琼脂糖酶消化过的样品移至一透析袋中，扎好或封好后将透析袋放在含100mlTE(pH8.0)的烧杯或三角瓶中。 ②4℃透析样品数小时。
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